下调miR-10a对脓毒症...型大鼠ERK信号通路的影响_李莹.pdf

下调 mi-10a 对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠 EK 信号通路的影响李莹林建东林晓肖文彪郭清清林炳文廖秀玉(福建医科大学附属第一医院重症医学科，福建福州350005)摘要 目的分析下调微小 NA-10a(mi-10a)对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶(EK)信号通路的影响。方法选取 60 只 SPF 级雄性大鼠，其中 15 只为空白组，其余 45 只采用经典的盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肾损伤大鼠模型，最终 45 只大鼠均建模成功，随机分为模型组、上调组、下调组各 15 只。在建模后上调组尾部注射含 10 lmi-10a 过表达慢病毒悬液，下调组尾部注射10 l mi-10a 沉默慢病毒悬液。空白组、模型组不进行任何处理，24 h 后观察大鼠变化。鉴定 mi-10a 转染效率，对比各组肾功能、肾损伤、局部炎症反应相关指标、病理组织学变化、肾脏氧化应激指标及肾组织 EK 信号通路蛋白表达情况。结果与空白组相比，模型组、上调组、下调组 mi-10a 表达量明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组 mi-10a 表达量明显升高，下调组 mi-10a 表达量明显降低(P0.05)。与空白组相比，模型组、上调组、下调组肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子(KIM-1)、肿瘤坏死因子(TNF)-、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10、丙二醛(MDA)水平明显升高，超氧化物歧化酶(SOD)活性明显降低(均 P0.05)。与上调组相比，下调组 Cr、BUN、NGAL、KIM-1、TNF-、IL-1、IL-6、IL-10、MDA 水平明显降低，SOD 活性明显升高(均 P0.05)。与空白组相比，模型组、上调组、下调组细胞外信号调节激酶(EK)、p-EK、丝裂原活化蛋白(MEK)、p-MEK 蛋白表达量明显升高(P0.05);与上调组相比，下调组 EK、p-EK、MEK、p-MEK 蛋白表达量明显降低(P0.05)。结论下调 mi-10a 可明显抑制脓毒症并发急性肾损伤肾脏氧化应激程度，抑制局部炎症，修复肾损伤，其作用机制可能与促使 EK 信号通路失活相关。关键词 微小 NA-10a;脓毒症;急性肾损伤;细胞外信号调节激酶信号通路中图分类号 692.05 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0615-04;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.029基金项目:福建省自然科学基金项目(No 2016J01539)通信作者:廖秀玉(1970-)，女，硕士，副主任医师，主要从事急性肺损伤、脓毒症研究。第一作者:李莹(1985-)，女，博士，主治医师，主要从事老年重症医学、脓毒症研究。脓毒症属于一种可累及多个器官、系统的因感染所致的全身性炎症反应综合征，急性肾损伤是脓毒症进展过程中最为严重的一种并发症，急性肾损伤的发生在一定程度上威胁着患者的生命安全，并发此并发症的患者预后生存期均较短1，2。目前临床研究认为脓毒症并发急性肾损伤的发生与多种因素相关，微小 NA(miNA)在该病发生过程中具有重要的作用，mi-10a 属于 miNA 家族成员之一，其被证实与脓毒症并发急性肾损伤相关3。本文分析下调微小 NA-10a(mi-10a)对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠细胞外信号调节激酶(EK)信号通路的影响。1材料与方法1.1材料研究动物:选取60 只 SFP 级雄性大鼠，购自慕恩(广州)生物科技有限公司，动物许可证号:SYXK(粤)2020-0225，6 8 周龄，平均体重(252.1625.26)g，在相对湿度为 30%35%、温度为(23.81.5)下饲养 1 w，每日光照 24 h，明暗周期为12 h。本试验操作均严格参照动物实验伦理要求相关规定进行，且获得医院伦理委员会审批同意。主要试剂:mi-10a 慢病毒载体构建由上海吉玛公司设计并完成，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒及相关试剂均由美国 D 公司提供，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒及相关试剂均由美国 Cayman 公司提供，小鼠抗大鼠 EK 抗体由深圳市豪地华拓生物科技有限公司提供，兔抗人 p-EK抗体由上海冠导生物工程有限公司提供，兔抗大鼠MEK 抗体由北京义翘神州科技股份有限公司(SinoBiological Inc)提供，小鼠抗大鼠 p-MEK 抗体由上海梵态生物科技有限公司提供。1.2分组及建模随机选取 60 只 SPF 级雄性大鼠，其中 15 只为空白组，其余 45 只采用经典的盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肾损伤大鼠模型，对大鼠行常规20 mg/kg的 2%戊巴比妥腹腔麻醉后，以腹部正中为操作切口，制备大约 1 cm 的切口，将腹膜逐层打开，找到盲肠后对其远端行游离处理，将盲肠中的粪便挤向远端，盲肠中段使用 3 号丝线结扎，盲肠远端使用 12 号针头做穿孔处理，将少量粪便挤压至盲肠表面，之后回纳盲肠、缝合腹膜、关闭腹腔，术后大鼠进行单笼饲养。建模后大鼠表现为直肠温516李莹等下调 mi-10a 对脓毒症并发急性肾损伤模型大鼠 EK 信号通路的影响第 3 期度较建模前升高1、呼吸频率、心率为建模前的 2倍，精神萎靡、竖毛、口鼻分泌物增多及少动等表现为建模成功标准，最终 45 只大鼠均建模成功，随机分为模型组、上调组、下调组各 15 只。1.3mi-10a 慢病毒载体构建及滴定使用 Gen-Bank 查找序列获得 mi-10a 序列，构建 mi-10a 过表达转染质粒(上调)、mi-10a 沉默转染质粒(下调)，由上海吉玛公司设计并合成，并做慢病毒滴度测定(病毒滴度为 1109TU/ml)。在建模后上调组尾部注射含 10 l mi-10a 过表达慢病毒悬液，下调组尾部注射 10 l mi-10a 沉默慢病毒悬液。空白组、模型组不进行任何处理，24 h 后观察大鼠变化。1.4mi-10a 转染效率鉴定在 mi-10a 转染完成 24h 后，采用实时荧光定量聚合酶链反应(T-PC)检测 mi-10a 转染效率，随机选取每组 5 只大鼠，使用 5%苯巴比妥做常规腹腔注射麻醉后处死，迅速取肾组织，提取肾组织 NA，逆转录获得 cD-NA。以 U6 为内参照，mi-10a 上游序列 5-ACAT-CATACCCTGTAGAACCGAA-3，下游:5-GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC-3;U6 上游序列 5-CTCGCT-TCGGCAGCACA-3，下 游:5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。1.5样本采集采集各组剩余 10 只大鼠尾部静脉血 1.5 ml，分离血清备用。静脉血采集完成后做实验动物常规麻醉后迅速取肾组织，分为 3 等份，其中1 份做组织切片，另外 2 份在液氮中保存用于后续指标检测。1.6肾功能、肾损伤、局部炎症反应相关指标测定采用 ELISA 测定肾功能指标肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肾损伤分子(KIM)-1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、局部炎症反应相关指标肿瘤坏死因子(TNF)-、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10 水平，取所制备的血清，将 ELISA 检测试剂盒放置于室温下做平衡 20 min 处理，之后将不同浓度的 50 l 标准品加入至标准孔中，将 50 l 待测样品加入至样本孔中，每孔中加入 100 l 的辣根过氧化物酶标记的检测抗体，密封反应孔，在温度为 37的环境下孵育 1 h，将上清液弃除后加入350 l的洗涤液，在室温环境下孵育1 min，弃除上清液，重复上述步骤 5 次，之后将 50 l 的底物 A、底物 B 加入至每孔中，37 孵育 15 min，之后终止反应，获得 Cr、BUN、NGAL、KIM-1、TNF-、IL-1、IL-6、IL-10 水平。1.7病理组织学观察取肾组织切片，脱蜡、脱水后行苏木素-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察肾组织病理变化。1.8肾脏氧化应激指标检测取 1 份液氮中所保存的肾组织，制备为组织匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定氧化应激指标 SOD 活性，采用改良硫代巴比妥酸法测定氧化应激指标 MDA 水平。1.9肾组织 EK 信号通路蛋白检测采用 West-ern 印迹测定肾组织 EK 信号通路蛋白表达量，取1 份液氮中保存的肾组织，提取组织总蛋白，取20 g蛋白质样本，电泳 1.5 h 后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在室温下做封闭处理，之后分别加入1 1 000 TBST 给予稀释的 EK 信号通路蛋白 EK、p-EK、丝裂原活化蛋白(MEK)、p-MEK 一抗，使用1 2 500 的辣根过氧化氢酶标记的二抗在室温下孵育处理，电化学发光(ECL)显色，使用 Labwork 凝胶图像扫描所获得胶片，以 GAPDH 为内参，计算EK、p-EK、MEK、p-MEK 蛋白表达量。1.10统计学处理采用 SPSS25.0 软件，计量资料经 Levene 法检测具备方差齐性，Shapiro-wilk 检验符合正态分布，多组间比较采用方差齐性检验，两组间比较采用独立样本 t 检验。2结果2.1转染效率鉴定与空白组(1.140.35)相比，模型组、上调组、下调组 mi-10a 表达量(2.46 0.84、3.251.02、1.990.32)明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组 mi-10a 表达量升高，下调组mi-10a 表达量降低，有统计学差异(P0.05)，说明 mi-10a 转染成功。2.2各组肾功能、肾损伤相关指标对比与空白组相比，模型组、上调组、下调组各指标水平明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组各指标水平明显升高，下调组各指标水平明显降低(P0.05);与上调组相比，下调组各指标水平明显降低(P0.05)。见表 1。2.3各组局部炎症反应指标对比与空白组相比，模型组、上调组、下调组各指标水平明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组各指标水平明显升高，下调组各指标水平明显降低(P0.05);与上调组相比，下调组各指标水平明显降低(P0.05)。见表 1。2.4各组肾脏组织学观察空白组肾组织结构正常，无病变;模型组肾组织可见有细胞水肿、炎性浸润、肾小管闭塞、肾小球皱缩表现;上调组肾组织可见有较模型组更为严重的细胞水肿、大量的炎性浸润、肾小管闭塞、肾小球皱缩表现;下调组肾组织可见细胞水肿、炎性浸润现象改善，肾小管、肾小球病616中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷变缓解。见图 1。2.5各组肾脏氧化应激程度对比与空白组相比，模型组、上调组、下调组 SOD 活性明显降低，MDA水平明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组SOD 活性明显降低，MDA 水平明显升高，下调组SOD 活性明显升高，MDA 水平明显降低(P0.05);与上调组相比，下调组 SOD 活性明显升高，MDA 水平明显降低(P0.05)。见表 2。2.6各组肾组织 EK 信号通路蛋白表达对比与空白组相比，模型组、上调组、下调组各蛋白表达明显升高(P0.05);与模型组相比，上调组各蛋白表达明显升高，下调组各蛋白表达明显降低(P 0.05);与上调组相比，下调组各蛋白表达量明显降低(P0.05)。见表 2、图 2。表 1各组肾功能、肾损伤及局部炎症反应指标对比(xs，n=10)组别肾功能指标Cr(mol/L)BUN(mmol/L)肾损伤指标NGAL(ng/ml)KIM-1(ng/L)局部炎症反应指标(pg/ml)TNF-(pg/ml)IL-1(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-10(pg/ml)空白组22.263.127.561.083.850.4922.342.13200.2420.1395.239.24227.4925.16125.2613.34模型组54.255.551)20.232.981)7.262.231)75.267.121)589.6264.251)265.4929.561)846.