乌司他丁调控PI3K_AK...舒张功能的影响及其机制研究_苗婷.pdf

1345 中国循证心血管医学杂志2022年11月第14卷第11期 Chin J Evid Based Cardiovasc Med,November,2022,Vol.14,No.11 论著 乌司他丁调控PI3K/AKT通路对大鼠心脏术后心脏收缩及舒张功能的影响及其机制研究苗婷1，王道金1，湛守青1基金项目：青海省科技计划项目(2017-ZJ-754)作者单位：1 810000 西宁,青海省心脑血管病专科医院心脏外科重症医学科通讯作者：苗婷,E-mail:doi：10.3969/j.issn.1674-4055.2022.11.13【摘要】目的 探究乌司他丁调控肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路对大鼠心脏术后心脏收缩及舒张功能的影响和机制。方法 将大鼠分为对照组、心脏手术组、心脏手术+乌司他丁组（每组各15只）。心脏手术组、心脏手术+乌司他丁组构建心脏手术模型，心脏手术+乌司他丁组以乌司他丁腹腔内注射（100 kU/kg），1/d，连续7 d。通过检测左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS）评估心脏功能。比较各组炎性细胞因子水平、PI3K和AKT蛋白的表达量。结果 三组大鼠的LVEF、LVFS、炎性细胞因子水平、PI3K和AKT蛋白的表达量差异显著（P0.05）。心脏手术组的LVEF、LVFS、PI3K和AKT蛋白的表达量显著低于对照组，白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-6（IL-6）显著高于对照组（P0.05）。心脏手术+乌司他丁组的LVEF、LVFS、PI3K和AKT蛋白的表达量显著高于心脏手术组，IL-1和IL-6显著低于心脏手术组（P0.05）。结论 乌司他丁可提高心脏手术大鼠的心功能，并促进PI3K/AKT通路。【关键词】心脏手术；乌司他丁；PI3K/AKT；心脏功能；大鼠【中图分类号】R654.2 【文献标志码】A 开放科学（源服务）标识码（OSID）Influence and mechanism of ulinastatin on cardiac systolic and diastolic functions through regulating PI3K/AKT pathway in rats after cardiac surgery Miao Ting*,Wang Daojin,Zhan Shouqing.*Intensive Care Unit,Hospital of Cardio-Cerebrovascular Diseases of Qinghai Province,Xining 810000,China.Corresponding author:Miao Ting,E-mail:Abstract Objective To investigate the influence and mechanism of ulinastatin on cardiac systolic and diastolic functions through regulating PI3K/AKT pathway in rats after cardiac surgery.Methods All rats were divided into control group,cardiac surgery group and cardiac surgery+ulinastatin group(each n=15).The model of cardiac surgery was established in cardiac surgery group and cardiac surgery+ulinastatin group,and surgery+ulinastatin group was given intraperitoneal injection of ulinastatin(100 kU/kg)once a day for 7 d.The heart function was reviewed through detecting left ventricular ejection fractions(LVEF)and left ventricular fraction shortening(LVFS).The levels of inflammatory cytolines and protein expressions of PI3K and AKT were compared in all groups.Results The levels of LVEF,LVFS and inflammatory cytolines and protein expressions of PI3K and AKT had significant differences among 3 groups(P0.05).The levels of LVEF and LVFS and protein expressions of PI3K and AKT were significantly lower,and levels of interleukin-1(IL-1)and interleukin-6(IL-6)were significantly higher in cardiac surgery group than those in control group(P0.05).The levels of LVEF and LVFS and protein expressions of PI3K and AKT were significantly higher,and levels of IL-1 and IL-6 were significantly lower in cardiac surgery+ulinastatin group than those in cardiac surgery group(P0.05).Conclusion Ulinastatin can improve heart function and promote PI3K/AKT pathway in rats undergone cardiac surgery.Key words Cardiac surgery;Ulinastatin;Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B;Heart function;Rats 在心脏手术期间使用的体外循环可导致白细胞激活，进而引发全身的氧化应激和炎症反应，损伤心肌组织并引起心功能障碍1。保护心肌组织，及时恢复心功能具有重要临床意义。乌司他丁是在尿液中发现的一种库尼茨型人类蛋白酶抑制剂，具有抑制中性粒细胞弹性蛋白酶和抑制促炎细胞因子激活的能力2。研究显示，乌司他丁可以在心脏手术后抑制促炎细胞因子水平的增加3，但其对心脏功能的影响和作用机制仍不清楚。肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）是细胞内激酶通路，该通路水平的升高能够促进抗氧化和抗炎因子的分泌4。研究表明提高PI3K/AKT通路能够缓解由缺血/再灌注引起的心肌组织损伤5。本文主要分析乌司他丁调控PI3K/AKT通路对大鼠心脏术后心脏收缩及舒张功能的影响，为临床更好的提高心脏手术预后提供理论依据。1 材料与方法中国循证心血管医学杂志2022年11月第14卷第11期 Chin J Evid Based Cardiovasc Med,November,2022,Vol.14,No.11 1346 1.1 主要实验材料 Sprague-Dawley（SD）大鼠（SPF级，雄性，810周，270290 g）。HP SONOS 5500型的超声心动图仪（飞利浦公司，美国）。乌司他丁（H19990131，常州天普制药）。HE染色试剂盒购自武汉华美公司（中国）。显微镜（蔡司，德国）。ELISA染色试剂盒（碧云天公司，中国）。酶标仪（Model 680，Bio-Rad，美国）。抗体（Abcam公司，美国）。聚偏二氟乙烯膜（EMD 心脏手术llipore，美国）。ECL显色试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）。1.2 分组、建模和干预 45只大鼠随机分为对照组、心脏手术组、心脏手术+乌司他丁组（每组各15只）三组。根据参考文献建立心脏手术大鼠模型6，将心脏手术组和心脏手术+乌司他丁组的大鼠连接心电图，麻醉（4%水合氯醛）后连接心电图，迅速打开胸小心撕开心包腔暴露心脏，在结扎心脏的同时进行体外循环，持续2 h。将心脏迅速放回胸腔内，简单缝合胸腔，腹腔注射8105 U的青霉素预防感染。对照组大鼠仅暴露心脏相同时间但不结扎。心脏手术+乌司他丁组大鼠在建模后通过乌司他丁腹腔注射处理，剂量为100 kU/kg，1/d，连续7 d7。1.3 检测指标和方法1.3.1 心功能检测 通过HP SONOS 5500型的超声心动图仪的双通道左心室射血分数（LVEF）和左心室缩短分数（LVFS），评估左心室收缩功能。1.3.2 HE染色 大鼠吸入过量二氧化碳安乐死，心肌组织用10%甲醛溶液固定48 h，流水冲洗。不同浓度的乙醇脱水，将组织浸入蜡中，切成47 m的厚度。将载玻片置于65 恒温烘箱中30 min。脱蜡切片用不同浓度乙醇浸泡5 min，自来水冲洗10 min。切片分别用伊红溶液染色12 min。细胞核用苏木精染色5 min。染色切片用纯酒精脱水并在光学显微镜下检查。1.3.3 酶联免疫吸附测定（ELISA）大鼠安乐死前收集微静脉血，离心（4，20 min，12 000 rpm）后使用移液枪小心吸取上层清液，加入抗体孵育2 h后加入显色剂，10 min后终止反应。在450 nm下检测吸光度，根据试剂盒标准曲线计算单位质量黑质组织中白细胞介素（IL）-1、IL-6的水平。1.3.4 Western blot检测蛋白 将心肌组织用匀浆机均匀研磨萃取总蛋白，通过BCA试剂盒测量浓度。每组取40 g的总蛋白使用SDS-PAGE分离（10%，80120 V，90 min）。在100 mV的恒定电压下与PVDF膜进行湿转移。在5%牛血清白蛋白（BSA）中于室温孵育1 h。将1:500稀释的PI3K和AKT一抗添加膜中（4，12 h）。洗涤后在加入1:2000稀释的二抗孵育室温下1 h。利用化学发光试剂盒显色。用Image J软件分析蛋白条带灰度值。1.4 统计学分析 统计分析使用SPSS 19.0软件。每个检测进行3次平行实验，数据以平均数标准差（SD）表示。多组间的差异采用单因素方差分析进行比较，两两比较采用LSD-t检验。P0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 乌司他丁对心脏手术大鼠心功能的影响 三组大鼠的左心室舒缩功能比较差异显著（P0.05）。心脏手术组的心脏指数LVEF（63.844.37）%和LVFS（34.572.76）%显著低于对照组（P0.05），心脏手术+乌司他丁组的心脏指数LVEF（81.495.21）%和LVFS（41.863.05）%显著高于心脏手术组（P0.05），表1。表1 乌司他丁对心脏手术大鼠心功能的影响组别nLVEF（%）LVFS（%）对照组1592.264.8548.233.14心脏手术组1563.844.37a34.572.76a心脏手术+乌司他丁组1581.495.21ab41.863.05ab 注：LVEF：左心室射血分数；LVFS：左心室缩短分数；与对照组比较，aP0.05；与心脏手术组比较，bP0.052.2 乌司他丁对心脏手术大鼠左心室心肌组织损伤的影响 对照组细胞核染色清晰，细胞质染色均匀，细胞排列有序。心脏手术组细胞核染色变深或变浅，心肌细胞染色变浅，形状发生改变，排列紊乱，并且出现炎性浸润。心脏手术+乌司他丁组组细胞排列异常和损伤情况均较轻（图1）。图1 HE染色检测乌司他丁对心脏手术大鼠左心室心肌组织损伤的影响（200