雾化吸入母牛分枝杆菌减轻哮喘小鼠氧化应激水平_方莉婷.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）雾化吸入母牛分枝杆菌减轻哮喘小鼠氧化应激水平*方莉婷，章谦男，肖欢，李超乾（广西医科大学第一附属医院急诊科，南宁530021）摘要目的：研究雾化吸入母牛分枝杆菌（微卡）对卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘小鼠氧化应激水平的影响及其可能的机制。方法：将18只68周Balb/C雄性小鼠随机分为对照组、哮喘组、微卡干预组，每组6只；利用OVA对哮喘组和微卡干预组小鼠致敏和激发建立哮喘模型，微卡干预组在每次激发前予雾化吸入微卡进行干预，对照组予等量生理盐水进行致敏和激发；于末次激发24 h内行肺功能检测；苏木精伊红（HE）染色、过碘酸雪夫（PAS）染色观察肺组织病理改变、气道杯状细胞增生情况；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测肺泡灌洗液（BALF）中白介素（IL）-4、白介素（IL）-13及干扰素（IFN）-水平；检测肺组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及还原型谷胱甘肽（GSH）含量；蛋白免疫印迹实验（western blotting）检测核因子E2相关因子（Nrf2）、血红素加氧酶1（HO-1）蛋白表达水平；实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测Nrf2、HO-1mRNA表达水平。结果：雾化吸入微卡改善哮喘小鼠气道高反应性、肺组织炎症反应及杯状细胞增生（均P0.05），降低BALF中IL-4和IL-13水平（P0.01），促进IFN-分泌（P0.01），上调SOD、GSH水平（均P0.05），减少MDA含量（P0.01），肺组织Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达增加（均P0.05）。结论：雾化吸入微卡可能通过调节Nrf2/HO-1通路减轻OVA诱导哮喘小鼠氧化应激。关键词支气管哮喘；母牛分枝杆菌；氧化应激；Nrf2；HO-1中图分类号：R562.25文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-1931-06DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.010Reduction of oxidative stress in asthmatic mice by aerosol inhalation of Mycobacterium vaccaeFang Liting，Zhang Qiannan，Xiao Huan，Li Chaoqian.（Department of Emergency,The First Affiliated Hospitalof Guangxi Medical University,Nanning 530021,China）AbstractObjective:To study the effects of aerosol inhalation of Mycobacterium vaccae(M.v.)on oxidativestress in ovalbumin(OVA)-induced asthmatic mice and its possible mechanism.Methods:Eighteen male Balb/Cmice of 6-8 weeks were randomly divided into normal control(NC)group,asthma(OVA)group and asthma mod-el withM.v.group,with 6 mice in each group.Mice in OVA group and M.v.group were sensitized and challengedwith OVA to establish asthma models.Mice in M.v.group received aerosol inhalation with M.v.before each chal-lenge,while mice in NC group were sensitized and challenged with the same amount of normal saline.Lung func-tion was detected within 24 hours after the last challenge;HE and PAS staining were used to observe the patho-logical changes of lung tissue and goblet cell proliferation in the airway;the levels of interleukin(IL)-4,interleu-kin(IL)-13 and interferon(IFN)-in BALF were detected by ELISA;the contents of malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and reduced glutathione(GSH)in lung tissue were measured;the protein expres-sions of Nrf2 and HO-1 were detected by western blotting and the expression levels of Nrf2 and HO-1 mRNA byreal-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).Results:Aerosolized inhalation of M.v.improved airway hyperresponsiveness,lung inflammation and goblet cell hyperplasia in asthmatic mice(all P0.05),decreased the levels of IL-4 and IL-13 in BALF(P0.01),promoted the secretion of IFN-(P0.01),up-regulated the levels of SOD and GSH(all P0.05),decreased MDA content(P0.01)as well as increased themRNA and protein expressions of Nrf2 and HO-1 in lung tissue(P0.05).Conclusion:Aerosol inhalation ofM.v.may reduce the oxidative stress in OVA-inducedasthmatic mice by regulating Nrf2/HO-1 pathway.Keywordsbronchial asthma；Mycobacterium vac-cae；oxidative stress；Nrf2；HO-1*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81860005）；广西自然科学基金资助项目（No.2020GXNSFDA238003；No.2019GXNSFAA185037）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-09-05 1931广西医科大学学报2022 Dec；39（12）支气管哮喘是以可逆性气流阻塞和气道高反应性为特征的异质性疾病，Th1/Th2免疫失衡被认为是支气管哮喘的经典致病机制1。近年来，有越来越多的学者认为氧化应激参与哮喘的发病机制，与炎症反应关系密切。氧化应激是指体内氧化与抗氧化水平失衡的一种状态2。临床研究表明，与健康对照者相比，哮喘患者血浆氧化产物累积，并与肺功能降低、气道阻塞程度呈正相关关系，氧化物累积对气道造成直接损伤的同时还会诱导炎症细胞活化，进一步消耗体内抗氧化酶，加剧气道炎症反应3-4。由此可见，氧化应激参与支气管哮喘的发生与发展，并与气道炎症密切相关。在临床广泛应用糖皮质激素治疗哮喘引起患者耐药性增加的情况下，通过研究氧化应激在哮喘中的作用机制有助于增加未来辅助治疗哮喘的新策略。母牛分枝杆菌（微卡）是一种双向免疫调节剂，雾化吸入微卡可以直接作用于气管黏膜表面，调节T细胞增殖分化，激活机体固有免疫系统。本课题组前期研究表明，雾化吸入微卡能调节哮喘小鼠模型中Th1/Th2型细胞因子，减轻气道炎症反应5。本研究主要关注雾化吸入微卡对卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘小鼠氧化应激水平的影响及其可能的机制。1材料与方法1.1实验动物18只68周Balb/C雄性小鼠，体重1825 g，由长沙天勤生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK湘2019-0014。于广西医科大学实验动物中心饲养，动物实验通过广西医科大学动物伦理审查委员会批准（No.202110004）。1.2主要试剂与仪器OVA、乙酰甲胆碱（美国Sigma公司）；注射用微卡（22.5 g/支）（安徽龙科马生物制药有限责任公司）；氢氧化铝粉剂（成都科龙化工有限公司）；白介素（IL）-4、白介素（IL）-13、干扰素（IFN）-酶联免疫吸附试剂盒（ELISA）（武汉华美公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（南京建成生物）；核因子E2相关因子（Nrf2）抗体、血红素加氧酶1（HO-1）抗体、GAPDH抗体（美国CST公司）；荧光羊抗兔IgG（H+L）二抗（美国赛默飞公司）；BCA试剂盒（碧云天）；反转录试剂盒（日本Takara公司）；SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物公司）；引物（北京擎科生物公司）。WH-2000超声雾化器（上海医疗器械厂）；无创型动物肺功能仪（美国Buxco公司）等。1.3动物分组及哮喘模型建立将18只Balb/C雄性小鼠随机分为对照组、哮喘组及微卡干预组，每组6只。按需制备致敏混悬液（25 g 级 OVA和1 mg氢氧化铝粉剂溶于200 L生理盐水）并于第1、第8、第15天腹腔注射哮喘组及微卡干预组小鼠，每只0.2 mL。第2228天将已致敏的小鼠置于自制20 cm30 cm20 cm塑料容器中，每日定时予2%激发混悬液（400 mg V级OVA溶于20 mL 生理盐水）雾化激发30 min，微卡干预组在每次激发前2h予微卡（微卡注射液22.5g溶于10mL生理盐水）雾化吸入30 min进行干预。对照组用等量生理盐水进行致敏和激发。1.4肺功能检测各组小鼠末次雾化激发后24 h内进行肺功能检测，采用无创肺功能检测仪予0 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL 浓度的乙酰甲胆碱20 L依次激发各组小鼠，测定小鼠比气道阻力（sRaw）的变化。检测完毕24 h内处死小鼠并取材。1.5肺组织病理形态观察用4%甲醛固定小鼠左肺组织，室温放置24 h后行石蜡包埋、切片，切片厚4 m，脱蜡后行苏木精伊红（HE）染色和过碘酸雪夫（PAS）染色，光镜下观察肺组织病理形态学改变，进行病理半定量分析6-7。支气管和血管周围炎性细胞浸润评分标准：0分：几乎无炎症细胞；1分：少许炎性细胞浸润；2分：较多炎性细胞浸润；3分：大量炎性细胞浸润，部分集合成团；4分：大量炎性细胞浸润聚集成团围绕在气管与血管周围。气道杯状细胞增生程度评分标准：0分：气道内无杯状细胞；1分：杯状细胞占黏膜上皮细胞25%；2分：杯状细胞占黏膜上皮细胞2550%；3分：杯状细胞占黏膜上皮细胞5075%；4分：杯状细胞占黏膜上皮细胞75%。1.6ELISA用无菌PBS对小鼠行支气管肺泡灌洗3次，每次0.5 mL，肺泡灌洗液（BALF）回收率大于80%，离心后取上清转移至新的EP管，置于-80 冰箱待用。取适量BALF进行ELISA，检测IL-4、IL-193213及IFN-的水平，终止反应后用酶标仪测量450 nm光密度（OD）值，结果与标准曲线比