微小RNA-22-3p调控...充质干细胞心肌样分化的影响_钟晓鸣.pdf

书书书中 国 医 学 科 学 院 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAEVol.45 No.11基金项目:国家自然科学基金(81770296)论著微小 NA-22-3p 调控 Kruppel 样因子 6 表达对骨髓间充质干细胞心肌样分化的影响钟晓鸣，张蕾，姚新亮，刘洪洋，张媛，万琪琳，李彦明，程冠昌河南大学淮河医院心血管内科，河南开封 475000通信作者:李彦明电话:0371-23906832，电子邮件:摘要:目的探究微小 NA-22-3p(mi-22-3p)调控 Kruppel 样因子6(KLF6)表达对骨髓间充质干细胞(BMSC)心肌样分化的影响。方法分离并培养大鼠 BMSC，将第 3 代 BMSC 分为对照组、5-氮杂胞苷(5-AZA)组、模拟物阴性对照组、mi-22-3p 模拟物组、mi-22-3p 模拟物+空载质粒组、mi-22-3p 模拟物+KLF6 过表达质粒组;实时荧光定量PC(qT-PC)检测细胞中 mi-22-3p 及 KLF6 表达;免疫荧光化学染色法检测细胞结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白T(cTnT)、间隙连接蛋白 43(Cx43)表达;Western blot 检测 Desmin、cTnT、Cx43、KLF6 蛋白表达;流式细胞术检测 BMSC 凋亡情况;采用双荧光素酶报告基因实验分析 mi-22-3p 和 KLF6 的靶向关系。结果与对照组比较，5-AZA 组 BMSC 中 mi-22-3p(q=7.971，P 0.001)、Desmin(q=7.876，P 0.001)、cTnT(q=10.272，P 0.001)、Cx43 表达(q=6.256，P 0.001)以及细胞凋亡率(q=12.708，P 0.001)显著增加，而 KLF6 mNA(q=20.850，P 0.001)及蛋白表达(q=11.080，P 0.001)显著降低;与 5-AZA 组和模拟物阴性对照组比较，mi-22-3p 模拟物组 BMSC 中 mi-22-3p(q=3.591，P 0.001;q=11.650，P 0.001)、Desmin(q=5.975，P 0.001;q=13.579，P 0.001)、cTnT(q=7.133，P 0.001;q=17.548，P 0.001)、Cx43 表达(q=4.571，P=0.037;q=11.068，P 0.001)显著增加，而 KLF6 mNA(q=7.384，P 0.001;q=28.234，P 0.001)及蛋白表达(q=4.594，P=0.036;q=15.945，P 0.001)显著降低，mi-22-3p 模拟物组细胞凋亡率显著低于 5-AZA 组(q=8.216，P 0.001);与 mi-22-3p 模拟物+空载质粒组比较，mi-22-3p 模拟物+KLF6 过表达质粒组 KLF6 mNA(q=23.891，P 0.001)及蛋白表达(q=13.378，P 0.001)显著增加，Desmin(q=9.505，P 0.001)、cTnT(q=10.985，P 0.001)、Cx43 表达(q=8.301，P 0.001)显著降低，细胞凋亡率增加(q=4.713，P=0.029)。双荧光素酶报告基因实验发现 KLF6 是 mi-22-3p 的潜在靶基因。结论mi-22-3p 通过抑制 KLF6 表达来促进 BMSC 心肌样分化。关键词:微小 NA-22-3p;Kruppel 样因子 6;骨髓间充质干细胞;心肌样分化中图分类号:541.9文献标志码:A文章编号:1000-503X(2023)01-0001-08DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.15052MicroNA-22-3p egulates the Expression of Kruppel-like Factor 6 to Affect theCardiomyocyte-like Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem CellZHONG Xiaoming，ZHANG Lei，YAO Xinliang，LIU Hongyang，ZHANG Yuan，WAN Qilin，LI Yanming，CHENG GuanchangDepartment of Cardiovascular Medicine，Huaihe Hospital，Henan University，Kaifeng，Henan 475000，ChinaCorresponding author:LI YanmingTel:0371-23906832，E-mail:ABSTACT:ObjectiveTo explore the effect of microNA-22-3p(mi-22-3p)regulating the expres-中 国 医 学 科 学 院 学 报2February，2023sion of Kruppel-like factor 6(KLF6)on the cardiomyocyte-like differentiation of bone marrow mesenchymal stemcell(BMSC)Methodsat BMSC was isolated and cultured，and the third-generation BMSC was dividedinto a control group，a 5-azacytidine(5-AZA)group，a mimics-NC group，a mi-22-3p mimics group，ami-22-3p mimics+pcDNA group，and a mi-22-3p mimics+pcDNA-KLF6 group.eal-time fluorescent quan-titative PC(qT-PC)was carried out to determine the expression of mi-22-3p and KLF6 in cells.Immuno-fluorescence staining was employed to detect the expression of Desmin，cardiac troponin T(cTnT)，and connexin43(Cx43)Western blotting was employed to determine the protein levels of cTnT，Cx43，Desmin，andKLF6，and flow cytometry to detect the apoptosis of BMSC.The targeting relationship between mi-22-3p andKLF6 was analyzed by dual luciferase reporter gene assay.esultsCompared with the control group，5-AZA up-regulated the expression of mi-22-3p(q=7.971，P 0.001)，Desmin(q=7.876，P 0.001)，cTnT(q=10.272，P 0.001)，and Cx43(q=6.256，P 0.001)，increased the apoptosis rate of BMSC(q=12.708，P 0.001)，and down-regulated the mNA(q=20.850，P 0.001)and protein(q=11.080，P 0.001)levels of KLF6.Compared with the 5-AZA group and the mimics-NC group，mi-22-3p mimics up-regulated the expression of mi-22-3p(q=3.591，P 0.001;q=11.650，P 0.001)，Desmin(q=5.975，P 0.001;q=13.579，P 0.001)，cTnT(q=7.133，P 0.001;q=17.548，P 0.001)，andCx43(q=4.571，P=0.037;q=11.068，P 0.001)，and down-regulated the mNA(q=7.384，P 0.001;q=28.234，P 0.001)and protein(q=4.594，P=0.036;q=15.945，P 0.001)levels of KLF6.Theapoptosis rate of mi-22-3p mimics group was lower than that of 5-AZA group(q=8.216，P 0.001)Com-pared with the mi-22-3p mimics+pcDNA group，mi-22-3p mimics+pcDNA-KLF6 up-regulated the mNA(q=23.891，P 0.001)and protein(q=13.378，P 0.001)levels of KLF6，down-regulated the expression ofDesmin(q=9.505，P 0.001)，cTnT(q=10.985，P 0.001)，and Cx43(q=8.301，P 0.001)，andincreased the apoptosis rate(q=4.713，P=0.029).The dual luciferase reporter gene experiment demonstra-ted that KLF6 was a potential target gene of mi-22-3p.ConclusionMi-22-3p promotes cardiomyocyte-likedifferentiation of BMSC by inhibiting the expression of KLF6.Key words:microNA-22-3p;Kruppel-like factor 6;bone marrow mesenchymal stem cell;cardiomyocyte-like differentiationActa Acad Med Sin，2023，45(1):1-8急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由冠状动脉闭塞引起的急性缺血缺氧造成不可逆的心肌细胞坏死和心脏功能障碍，是全球人类疾病死亡的主要原因之一1-2。挽救濒死心肌，恢复心脏功能是治疗 AMI 的关键，许多研究学者认为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)分化为心肌样细胞对修复梗死心肌组织具有重要作用，因此，促进 BMSC 心肌样分化对于治疗 AMI 至关重要 3。微小 NA(microNA，miNA)作为内源性的小分子非编码 NA，可通过结合靶基因信使 NA 的 3非翻译区，调节基因表达，其已被证实在细胞生理病理过程中具有重要的调控作用 4。有研究发现，mi-22 参与心脏重塑及心肌细胞肥大过程，mi-22-3p 在 AMI 小鼠中表达下调，促进其表达可改善心肌损伤2，5。此外，mi-22-3p 过表达还可促进 BMSC 成骨分化6，但关于其是否参与 BMSC 心肌样分化还未可知。Kruppel 样因子6(Kruppel-like factor 6，KLF6)作为 KLF 家族成员之一，参与心肌、骨骼肌、平滑肌的发育及功能调控7-8。本研究通过探究 mi-22-3p 调控 KLF6 表达对BMSC 心肌样分化的影响，为 BMSC 向心肌样细胞分化的分子机制及 AMI 治疗提供参考。材料和方法实验动物