微生物组学的法医学应用新进展、挑战和机遇_雷梵章.pdf

法 医 学 杂 志 2022年 10月 第38卷 第5期微生物组学的法医学应用新进展、挑战和机遇雷梵章1，陈曼1，梅书燕1，方雅婷1，2，朱波峰11.南方医科大学法医学院 广州市法医多组学精准鉴识重点实验室，广东 广州 510515；2.安徽医科大学基础医学院，安徽 合肥 230031摘要：微生物群落演替与样本种族、性别、健康状况、生活方式、死亡时间等重要因素密切相关，具有较大的法医学潜在应用价值。本文总结了近年来微生物组学应用于法医学同一认定、地域特征鉴识、组织或体液来源鉴定以及死亡时间推断等方面的研究，并介绍了基于二代测序数据用于微生物学研究的主要机器学习算法。此外，还分析了当下法医微生物组学面临的检材提取与保存、标准化和数据库建设、伦理审查和实践适用性等问题。未来借助微生物多组学技术将有望以全面动态的角度探索微生态系统，从而推动法医微生物组学的应用发展。关键词：法医学；微生物组学；同一认定；地域特征鉴识；组织或体液来源鉴定；死亡时间推断；死因分析；综述中图分类号：DF795.2 文献标志码：A doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2022.520303文章编号：1004-5619（2022）05-0625-15New Advances，Challenges and Opportunities in Forensic Applications of MicrobiomicsLEI Fan-zhang1,CHEN Man1,MEI Shu-yan1,FANG Ya-ting1,2,ZHU Bo-feng11.School of Forensic Medicine，Southern Medical University，Guangzhou Key Laboratory of Forensic Multi-Omics for Precision Identification，Guangzhou 510515，China；2.School of Basic Medical Sciences，Anhui Medical University，Hefei 230031，ChinaAbstract：The succession of microbiota is closely associated with several essential factors,including race,sex,health condition,lifestyle,postmortem interval,etc.,and it has great potential application value in forensic medicine.This paper summarizes recent studies on the forensic applications of the microbiome,including individual identification,geographical feature identification,origin identification of the tissue or body fluid,and postmortem interval estimation,and introduces the current machine learning algorithms for microbiology research based on next-generation sequencing data.In addition,the current problems facing forensic microbiomics such as the extraction and preservation of samples,construction of standardization and database,ethical review and practical applicability are discussed.Future multi-omics studies are expected to explore micro ecosystems from a comprehensive and dynamic perspective,to promote the development of forensic microbiomics application.Keywords：forensic medicine;microbiomics;individual identification;geographical feature identification;origin identification of tissues and body fluids;postmortem interval estimation;analysis of death cause;review作为地球上最为丰富多样的生物资源之一，从土壤、水体到火山和冰川，从植物根际到人类体内腔道，微生物无处不在。微生物群落（microbiota）是原核生物与真核生物界中不同微生物的集合，其活动行为影 综述 基金项目：国家自然科学基金重点资助项目（81930055）作者简介：雷梵章（1997），男，硕士研究生，主要从事法医物证学研究；E-mail：通信作者：朱波峰，男，教授，博士，主要从事法医学教学及法医物证学研究；E-mail：引用格式：雷梵章，陈曼，梅书燕，等.微生物组学的法医学应用新进展、挑战和机遇J.法医学杂志，2022，38（5）：625-639.To cite：LEI F Z，CHEN M，MEI S Y，et al.New advances，challenges and opportunities in forensic applications of microbiomicsJ.Fayixue Zazhi，2022，38（5）：625-639.625Journal of Forensic Medicine,October 2022,Vol.38,No.5响着微生物结构、代谢物、可移动遗传元件以及栖息地环境中的游离DNA1，同时通过微生物-环境-宿主之间独特的相互作用组成了动态多样的微生态环境。自2007年人类微生物组计划（The Human Microbiome Project，HMP）启动以来，各个国家和国际组织也相继响应，如地球微生物组计划（Earth Microbiome Project，EMP）、美国国家微生物组计划（National Microbiome Initiative，NMI）以及我国的中国科学院人类微生物组计划等。同时，DNA 测序技术和数据分析技术的快速发展提高了研究人员对不同环境中复杂微生物群落组成结构及其动态变化的认识2，这使得微生物组（microbiome）这一概念在被提出后逐渐成为生命科学领域的研究热点3。尽管微生物组通常被定义为“微生物群的基因和基因组，以及微生物群与宿主环境的产物”4，然而这一定义并不能概括当前所有领域中的微生物组研究。根据 2020年 MicrobiomeSupport研讨会的意见1，微生物组的定义被重新修订为“具有独特理化性质和合理明确栖息地的特征性微生物群落”，同时微生物组的含义还包括了这些微生物的活动影响范围及生态位。由此可见，微生物组及周围环境所组成的动态微生态系统是微生物组学的主要研究对象，而微生态系统中的微生物群落演替模式则可在一定程度上反映环境-宿主影响因素的变化。这些反映人类微生物群落演替规律的相关影响因素可为明确犯罪嫌疑人和被调查对象的种族、性别、年龄、健康状况、地理位置、饮食习惯、生活习惯、职业情况等信息提供重要依据，而环境微生物组的群落结构可用于对样本所处的地理环境情况进行推断。基于上述特点，微生物组学可应用于法医学同一认定、地域特征鉴识、组织或体液来源鉴定、死因分析、死亡时间（postmortem interval，PMI）推断、死后淹没时间（postmortem submersion interval，PMSI）推断等研究中。本文通过介绍微生物组学分析技术、法医学领域相关的微生物组学及其法医学应用等方面，系统阐述了微生物组学在法医学领域的应用研究进展，并对其在法医学实践中所面临的问题和前景进行总结。1微生物组学主流分析技术1.1 标记基因分析标记基因分析是一种对特定基因区域周围的保守区设计引物以获得标记基因的扩增子，从而进行微生物组分析的方法5。常用的标记基因包括细菌和古细菌的 16S rRNA基因以及真菌的 18S rRNA基因和内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）。在对上述标记基因进行扩增后，一般按照 97%的序列相似性的阈值对扩增子进行聚类并分组，得到细菌的分类操作单元（operational taxonomic unit，OTU）6，最后根据数据库已知信息将每个 OTU所代表的序列进行分类学注释。这种方法通过 97%的相似性将多个序列模糊成抽象一致的单个序列，虽然在分子生物学技术的早期发展阶段可以一定程度上减少 PCR和测序错误的影响，但其分类学注释水平也随之降低。近年来随着测序技术的发展，有学者认为上述阈值存在一定的局限性，以 16S rDNA 全长和 V4 高变区为例，理论上最优的 OTU 聚类阈值应分别为 99%和100%7。此外，目前新兴的扩增子序列变异（amplicon sequence variant，ASV）分析则从根本上提高了物种分类注释水平8。该方法首先对目标区域的基因进行精准测序，再使用如 DADA2等概率模型对测序及扩增错误所产生的序列进行过滤9，随后将位于相同基因区域的 ASV作为最小分类单元直接与参考数据库进行比较，从而实现种水平以上的物种分类。然而，应用 ASV 或使用较高的聚类阈值可能会将单个原先的代表性微生物类群也分成多个类群8，从而降低研究结果的可解释性。因此，在法医学实践中应结合研究目的和实际情况选择分类方法，以获得更具研究意义的微生物类群结果。标记基因分析法的优点：（1）效率高、成本低；（2）适用于低生物量或宿主 DNA 污染程度较高的样品5；（3）文库构建简便，已有大量公共数据集可供参考；（4）与基因组含量的相关性较高，易于定量10。然而，该方法的缺点：（1）分辨率较低，限制在属水平，可获得的功能信息有限11；（2）不能区分 DNA是否来源于活体；（3）无法同时研究细菌、真菌以及病毒等物种12；（4）引物和可变区的选择对结果影响较大，同时易受到PCR扩增偏倚的影响13。1.2 宏基因组分析由于传统研究无法对多种微生物进行大规模培养以及测序，因此 HANDELSMAN 等14在对土壤微生物进行研究时首次提出了将环境中全部微生物遗传物质作为研究对象的概念宏基因组学。与标记基因分析相比，宏基因组分析可对样品中存在的所有DNA进行测序分析，包括真核生物DNA和病毒等。宏基因组分析法的优点：（1）分辨率高，可对微生物群落进行种、株水平的分类15；（2）可直接获得功能基因的相对丰度；（3）较少受到扩增偏倚的影响。缺点5：（1）成本较高，样本处理方法复杂；（2）对测序通量有一定要求，数据分析难度大；（3）无法区分 DNA是否来源于活体，无法获得表达信息；（4）易受宿主DNA及其细胞器的污染；（5）组装中产生的错误会降 626法 医 学 杂 志 2022年 10月 第38卷 第5期低群体平均微生物基因组的准确率。1.3 宏转录组分析上述两种方法仅对 DNA 序列进行分析，而对DNA来源生物体的存活与否并未加以区分，因此，在探究微生物功能时具有一定的局限性。宏转录组以活体中才能稳定表达的 RNA 为研究对象，可通过转录组数据直接获取微生物群落的基因表达和转录活性等信息。宏转录组分析的优点：（1）当与标记基因分析结合使用