微生物代谢调控策略研究进展_吴贺.pdf

2022 年12 月Dec.2022第 46 卷 第 6 期Vol.46,No.6热 带 农 业 工热 带 农 业 工 程程TROPICAL AGRICULTURAL ENCINEERING微生物代谢调控策略研究进展吴贺1)贺春萍2)（1 云南农业大学农学与生物技术学院 云南昆明 650201；2 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南海口 571101）摘要 微生物正常生长发育过程依赖于细胞内相互交联、配合形成的复杂代谢网络，其中有些通路会产生对人类有益的多种代谢产物，但多数产物生成量少且无法满足高需求，通过修饰改造微生物功能基因可提高目的产物的效率。本文就改变微生物代谢效率所用的代谢工程技术手段，包括微生物通路分析与遗传改造、菌株共培养调控策略、基于计算机预测的新型蛋白质工程以及与生物元件介导的动态调控策略等方面研究进行综述，并提出研究展望，以期为微生物代谢调控相关的研究提供参考。关键词 代谢工程；微生物；动态调控；发酵；代谢产物中图分类号 Q939.99 Advances in Microbial Metabolic Regulation StrategiesWU He1)HE Chunping2)(1 College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming,Yunnan 650201;2 Environment and Plant Protection Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou,Hainan 571101)Abstract The process of normal growth and development of microorganisms depends on the complex metabolic network formed by cross-linking and cooperation in cells,some of these pathways may produce a variety of metabolites beneficial to human beings.However,the production of most products is very small,which can not meet the high demand of human beings,and the efficiency of the target products can be improved by modifying the microbial functional genes.In this paper,we discuss metabolic engineering techniques used to change Microbial metabolism efficiency,including microbial pathway analysis and genetic modification,the development of co-culture colony strategies,and new types of protein engineering based on computer prediction,reviewed the aspects of research in the metabolic regulation strategies of biological element-mediated,and put forward the prospect of this research,for further providing reference for the study of microbial metabolism regulation.Keywords metabolic engineering;microorganism;metabolic regulation;fermentation;metabolic product微生物细胞工厂已被广泛应用于包括氨基酸1-2以及像维生素、生物碱3-5等多种代谢产物的大规模生产。与化学合成和直接提取法相比，微生物发酵具有产率较高、环境污染小或无污染、操作简单、不需要大量活体材料等独特优势，代谢工程是指利用多基因重组技术有目的的对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。自20世纪90年代提出代谢工程概念6-7，历经多年发展，代谢工程技术已被成功应用于多种生 基金项目：海南省自然科学基金项目（No.320RC692）；海南省院士创新平台科研专项项目（No.SQ2020PTZ0011）。收稿日期：2022-03-07；编辑部E-mail：；责任编辑：汪全伟。吴贺，男，在读硕士研究生。研究方向为微生物与分子生物学。通讯作者：贺春萍，女，研究员，硕士研究生，硕士生导师。研究方向为微生物学。-134吴贺 等 微生物代谢调控策略研究进展物化工产品和医药制品生产，如谷氨酸棒杆菌生产-羟基脂肪酸8，重组大肠杆菌合成生松素9。早期的代谢工程主要基于菌株自身代谢条件，通过对能产生含有目标产物的原始菌株进行筛选，挑出天然条件下合成效率最高的菌株进行后续优化，包括提升关键反应效率，限制或消除不利于产物合成的副反应进行，以便人工改造出最适于合成目标产物的工程菌10-11。实际操作过程中有些菌株经过改造后，不仅不能提高目的产物合成效率，连自身正常的生长发育都很难保证12，而发酵过程中内部环境的不断变化，同样也会影响到菌株的生长和产物表达，特别是次级代谢产物13。根据查阅前期相关文献，微生物发酵过程效率低下大致有以下原因：中间代谢物的积累形成反馈抑制降低目的产物产率；细胞生长和产物合成中能量和前体物质的竞争会紊乱微生物整体代谢过程；产物生成过程中有毒、有害物质的大量积累毒害细胞；产物生成受到有关限速酶的抑制。实际生产过程中不仅要考虑菌株的正常生长，还要考虑产物的合成效率，因此，生物学家提出基于传统代谢工程与现代计算机模型预测相结合的新方案，如针对单一菌株的通路分析与基因改造，在此基础上发展共培养菌落策略以及基于计算机预测的新型蛋白质工程与生物元件（核糖体开关，转录因子，RNA调控）介导的动态调控策略。随着微生物代谢理论与代谢特性认识的不断深入，通过基因改造提升现有菌种的发酵性能，发掘新的调控元件，人工改造设计新酶，都可实现大规模代谢网络途径的修饰和构筑。1 通路分析与遗传改造 生物体内生化反应大多依赖于酶的催化，由于代谢网络中限速反应的效率主要与酶活性有关，因此，筛选编码限速酶的关键基因位点并进行合适的修饰改造，以提高反应速率积累目的产物，这是传统代谢工程的基本思路，也是增加产物产量最常用的方法之一。具体方法是对菌株代谢通路进行分析，确定限速位点和限速酶，利用基因编辑修饰限速酶基因，或转入外源基因产出高活性目标酶类，提高限速反应速率，提升目标产物产率。另一种方法是通过 CRISPR-Cas9 基因敲除技术去除某些副反应相关基因，阻断与目标途径相竞争的代谢途径，使底物和能量向目标反应倾斜，提升目标产物产量。在实际生产中两种策略往往联用以期达到更好的效果。如张齐全等14以毕赤酵母GS115为出发菌株，对肌醇合成通路的关键基因IPS进行过表达并敲除两个合成转运蛋白的基因，解除毕赤酵母对肌醇合成途径的代谢调控；同时选择两个外源肌醇合成基因转入毕赤酵母过表达，结果显示重组菌株的肌醇产量为 5.04g/L，与原始菌株相比，产量有明显提升。2 菌株共培养调控策略 微生物代谢工程可以根据需求在单个菌株中通过构建和优化代谢途径来生产代谢产物，但单个菌株无法应对时，效率会下降。因此，提出了将负责不同代谢物合成途径的微生物聚类在一起形成菌群，以减少单个菌株代谢负担，提高效率的新策略菌株共培养调控策略15-17（以下简称共培养调控策略）。共培养调控策略将完整的生物合成途径模块化，通过多种微生物各自负责某一特定模块井然有序地完成每一步反应（图1）。与传统的单菌株培养方法相比，共培养调控策略可以减少各菌株的代谢负担，能承受更剧烈的环境变化18。目前，该技术已应用于包括氨基酸、蛋白质、类黄酮、生物碱、萜类化合物等代谢产物的生产 19-20，如Jones J A等21通过4种不同大肠杆菌菌株的混合培养来合成天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，将天竺葵素-3-O-葡萄糖苷合成途径拆分为 4个模块。第一种菌株负责将葡萄糖、木糖和甘油转化为苯丙酸；第二菌株利用苯丙酸和外源添加的丙二酸生成黄烷酮；通过第三菌株负责将黄烷酮转化为黄烷醇；第四菌株过表达花青素合酶（ANS）和 3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）基因分别将黄烷醇转化为花青素，并分别对花青素进行糖基化修饰。利用共培养调控策略合成天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，最高产量为9.5 mg/L，是单培养物的11.2倍。共培养调控策略虽已取得较大进展，但仍处-1352022 年 12 月第 46 卷第 6 期热带农业工程于起步阶段，还需要进一步的优化。如共培养菌落策略如何确保共培养菌株中所有或绝大部分菌株都能在同一种生长条件下高效生长，并且菌株之间不会产生相互抑制的有毒化合物，这需要尽量选择同一种属菌株23。如应用共培养菌落策略当资源有限时，菌株之间就可能会产生竞争，最终破坏整个系统的稳态，可往培养体系不断添加新鲜培养液以维持大多数菌株最适生长条件。3 新型蛋白质工程策略 酶的催化是大多代谢反应高效完成的一种不可或缺的要素，酶在代谢工程中通常是作为生物催化剂调节代谢途径的反应效率，前期代谢工程大多集中在通过增加基因表达水平和酶浓度来改变代谢通量，然而大多天然酶在工业条件下稳定性较差，催化活性低，存在反馈抑制等问题，极大阻碍了天然酶在工业生物技术中的应用。作为系统代谢工程和合成生物学的有力工具，新型蛋白质工程通过基于计算机协助的“定向进化”“理性设计”两种策略构建具有所需特性的新型酶或蛋白质24，提高关键酶在天然代谢途径中的活性和效率，现已成为微生物代谢改造中不可或缺的方法之一。3.1定向进化（Directed evolution）策略定向进化已成为改善酶特性最有效的方法之一25，即通过构建突变文库，筛选改良变异库。此方法不需要了解蛋白质的结构信息26，近年来，对定向进化结果的筛选方法也有一定的研究，如Gul I等27用一种改造后的96孔板纸面高通量筛选法，在纸面上让酶和含目标底物的指示剂结合并反应，以指示剂单位时间内颜色强度变化度量酶活性大小。此方法快捷方便，也不需要昂贵的仪器和大量试剂，显示了纸基全细胞筛选与数字图像比色法相结合的潜力，是发现工业上重要酶极具前景的方法。3.2理性设计（Rational design）策略与定向进化不同，理性设计是通过改变蛋白质结构来实现预期目标，该方法要求使用者对蛋白质的分子结构信息有一定了解。随着结晶学、结构生物学和生物信息学算法的发展，人们可以准确设计出具有所需特性的蛋白质28-29。Wang H等30利用了一种基于抑制结合态和二次设计的合理分子设计，该策略包括：预测胃蛋白酶-BGL1复合物结构的相互作用点和关键氨基酸；通过结构评估优化胃蛋白酶抗性突变体；设计突变体的分子结构并构筑。图1共培养菌群生产代谢产物示意图22说明：（A）同一种类品系的共同培养；（B）不同物种品系的共同培养；（C）混合品系的共作图2定向进化（Directed evolution）和理性设计（Rational design）流程示意图24-136吴贺 等 微生物代谢调控策略研究进展3.3半理性设计（Semi-rational design）策略半理性设计策略是定向进化和理性设计策略的有机结合，即先根