微流控芯片恒温扩增技术快速检测多种呼吸道病原体的应用_池细俤.pdf

离、不要随地吐痰、不要乱摸检测区物品等，特别是就诊人员和陪诊人员也要加强手卫生消毒。参考文献：刘璐，张野，陈秀凤，等 年院内感染病例调查分析 传染病信息，（）：唐翔介入科医院感染的预防与控制管理中医药管理杂志，（）：夏孟，王雪梅介入科医院感染的预防与控制管理中国药业，（）：李宇，张哲，杜溪乔，等 新冠病毒变异株奥密克戎的变异特点及对免疫学特性的影响国际免疫学杂志，（）：中华人民共和国卫生部 医院感染诊断标准（试行）中华医学杂志，（）：胡国庆，段亚波 医院消毒卫生标准（）内容解读（二）中国消毒学杂志，：曾小红，杨艺，张曼琳 影像科医院感染危险因素与管理对策国际感染杂志（电子版），（）：蔡卫东，周海红，吴茂铸放射科院内感染及其影响因素分析医院管理论坛，（）：周玲放射科院内感染及防控措施探讨医院管理论坛，（）：汪旭珍，刘红，蒋海燕，等院感护士干预在提升放射科院感防控质量中的作用 中医药管理杂志，（）：徐建国放射科院内感染相关危险因素及防控措施研究医院管理论坛，（）：王岳新放射科院内感染相关危险因素及防控措施研究百科论坛电子杂志，（）：汪祖兰，绽立雯 放射科医院感染危险因素分析与预防策略思考实用临床护理学电子杂志，（）：王德华，兰军，徐亮 放射科院内感染的易感因素分析及管理对策中国医药指南，（）：许克文 医院放射科院内感染危险因素分析及预防措施 转化医学电子杂志，（）：田荣华，马芬，王艳，等放射介入手术室医院感染的原因与对策 中华医院感染学杂志，（）：王国珍放射介入室的职业危害因素及其防护措施中国卫生产业，（）：（收稿日期：）基金项目：福建省自然科学基金资助项目（）通讯作者文章编号：（）微流控芯片恒温扩增技术快速检测多种呼吸道病原体的应用池细俤，高世华，张忠源，叶桂云，陈家龙（福建医科大学附属南平第一医院 检验科，福建 南平 ）摘要：目的利用微流控芯片恒温扩增技术（）建立多种呼吸道病原体快速检测的方法，并对其临床应用的可行性和价值进行评估。方法设计和筛选针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体的 引物对，利用盘式微流控芯片建立快速检测方法。以人工构建的参考品确定 方法的检出限和分析特异性。收集 份呼吸道感染患儿的咽拭子样本，使用荧光定量 （）法与 进行平行检测，从灵敏度、特异性及总体符合率等方面比较两种方法在临床应用的相关性和差异。结果 检测方法对种呼吸道病原体的检出限为 。在 份样本中，以 方法为金标准，检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体的灵敏度分别为 、和 ；特异性分别为 、和 ；总体符合率为 、和 。结论采用 方法同时检测多种呼吸道病原体，特异性和灵敏度好，操作简单快速，适合快速检测的应用场景。关键词：呼吸道病原体；微流控芯片；恒温扩增；灵敏度；特异性中图分类号：文献标识码：，.（，）中国实验诊断学 年月第 卷第期 ：（）（），（），（），（），（），（），（），（），（），、，：；（，：）呼吸道感染性疾病具有高度传染性且传播迅速，对发病率和死亡率有显著影响。呼吸道感染病原学复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，其中 由病毒引发；病毒可通过飞沫、雾滴，或经污染的用具进行传播，可导致不分四季、任何年龄条件下的发病。其临床表现多样，主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重程度从自限性上呼吸道感染到严重甚至危及生命的下呼吸道感染，如气管炎、支气管炎及肺炎等。研究表明，的急性上呼吸道疾病和大部分的下呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。至少有个病毒科 多类共 个型别的病毒可引起急性呼吸道感染。临床常见的可导致呼吸道感染的病毒有甲型流感病毒（）、乙型流感病毒（）、呼吸道 合 胞 病毒（）、腺病毒（）、副流感病毒（）、偏肺病毒（）、博卡病毒（）、鼻病毒（）、冠状病毒（）等。因这些病毒传染性极强，传播速度快，潜伏期短，且临床症状相似，临床医师无法进行准确的区分，给临床诊断和治疗造成极大困难。因此，明确感染病原体对于控制传播途径、对人群采取预防措施、对临床选用针对性药物、避免滥用抗生素都极为重要。然而，用于诊断呼吸道病毒感染的常规检测方法，如病毒分离和血清学，无法满足快速诊断的需求。聚合酶链反应（）技术虽然弥补了传统诊断方法的不足，但大多基于实时荧光定量 ，对于基础实验室和社区医院来说并不方便。随着后新冠时代的到来，发热门诊快速筛查未知发热病原体成为了重要的医疗和社会关注的问题。环介导恒温扩增技术（）是一种结合了简单，快速，低成本等优点的检测技术，具有灵敏度高、特异性强及反应时长短等优势，被广泛开发及应用于各种病原体的检测，适合临床现场的即时检测（）。本团队前期研究中已经建立了基于 检测乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒的方法。本文在前期研究的基础上，基于盘状微流控技术和 技术，建立同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体的快速检测方法微流控芯片恒温扩增技术（），现将结果报道如下。资料和方法 一般资料 年月 年 月期间，收集 份具有急性呼吸道感染（）症状的本院门诊及住院呼吸道病原体感染患儿的咽拭子。患者中男童 例（）、女童 例（），年龄范围 天 岁（中位数岁）。仪器与试剂 仪器恒温扩增仪 复星诊断科技（上海）有限公司；型 仪（公司）；全自动核酸提取仪（台湾圆点公司）。试剂咽拭子（）；呼吸道病毒荧光定量 检测试剂 复星诊断科技（上海）有限公司；引物（上海百力格生物技术有限公司）；恒温扩增缓冲液 复星诊断科技（上海）有限公司；（上海罗氏制药有限公司）；酶、逆转录酶（菲鹏生物股份有限公司）；第二代甲乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品 和 （中国食品药品检定研 ，究院，批号 ）；其他病原体阳性参考品、核酸提取及纯化试剂 复星诊断科技（上海）有限公司。引物设计：根据甲型流感病毒（通用型）、乙型流感病毒（系和 系）、呼吸道合胞病毒（型和 型）、腺病毒（、型）、鼻病毒（、型）、副流感病毒（型、型、型）、肺炎支原体的序列设计 反应所需引物。根据在 中甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体的序列，利用 进行比对，使用 设计 反应所需引物（表）。表 引物序列名称序列（）中国实验诊断学 年月第 卷第期 微流控芯片微流控芯片（复旦大学随国栋教授惠赠），具共个扇区，每个扇区有套反应系统，每套反应系统具加样孔、分液孔、排气孔、毛细管道、反应孔等结构。试验时在加样孔加入模板液后通过芯片的分液孔、毛细管道等结构，在离心力作用下均匀地被输送到检测孔，份样本最多可同时独立进行个 试验，见图。图微流控芯片结构 方法 咽拭子采集用咽拭子轻轻擦拭咽部扁桃体及咽后壁，将咽拭子投入病原体运送培养基中，折断拭杆，使其完全置于管中。旋紧管盖，做好标记并放入塑料袋密封好，保管于 冰箱。参考品甲、乙型流感病毒国家参考品 用 无 酶的去离子水进行复溶，复溶后浓度分别为 、，试验时分别用无 酶的去离子水进行、倍稀释，然后作为待测样品使用，每个稀释度平行检测 次。其他病原体阳性参考品按厂家说明进行操作。本实验室分离的呼吸道标本中的大肠杆菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌等常见病原体用来验证特异性。核酸模板提取提取所需样本 。在 核酸自动纯化仪进行模板提取，提取纯化后的核酸样品应在小时内使用，或在 以下长期保存。提取所需样本体积为 ，并在每个待提取样本（含对照品）中加入内参。法使用冰盒进行试剂配制，按反应样本数（待检样本数量对照品个）配制反应液：向离心管内加入病毒缓冲液、反应液，振荡混匀，低速离心数秒，按每管 分装到反应管中，并在小时内进行荧光 扩增。分别取提取产物各 加入反应管中，盖紧管盖，瞬时离心，置于实时荧光定量 仪中。荧光 扩增步骤：反应 ，循环次；保温 ，循环次；，循环次；，循环 次。扩增检测过程约 。法检测制备微流控芯片：用 释稀检测反应液的各种成分，配制后各成分的终浓度见表。分别取，将种不同病原体的检测反应液置入芯片扇面的相应反应孔中，贴膜后置于 保存。加样及检测：将 混合酶（酶和逆转录酶）与 核酸提取液混合，震荡混匀，瞬时离心。向芯片的每个检测孔位加样 ，贴膜封口后置于恒温核酸扩增分析仪中。参考品在实验中按要求稀释，在检测孔内加 。恒温扩增仪实验参数设置：运行时间 ；上、下加热温度均；低速离心 ，；高速离心 ，；扫描间隔；光强为自动。结果判读：观察扩增曲线并记录起峰点的 值，当有典型扩增曲线且 值 为阳性；无扩增曲线或 值 为阴性。质量控制：每个检测批次都包括阴性对照、阳性对照，质控品。出现假阳性或假阴性则舍去本批实验结果，并进行复检。表反应液成分及浓度名称反应液溶液中的终浓度 结果 最低检测限采用甲、乙型流感病毒国家参考品，、稀释后进行检测，甲型流感病毒检出限为 （即 稀释），乙型流感病毒检出限为 （即 稀 释）。采 用 企 业 提 供 的 参 考 品，、稀释后进行检测，呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、副流感病毒和肺炎支原体的最底检测限分别是 ，和 （图）。图 法检测参考品和临床样本的荧光扩增曲线（参考品；临床样本）特异性各病原体检测孔均与大肠杆菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌等常见病原体无交叉反应，各病原体检测孔之间无相互交叉反应。临床标本检测结果在 份样本中，甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体用 方法分别检出、和 例，方法分别检出、和 例。以 方 法 为 金 标 准，检 出 上 述 病 原 体 的 灵 敏 度 分 别 为 、和 ；特 异 性 分 别 为 、和 ；总 体 符 合 率 为 、。具体结果如表所示。讨论微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，由微管道形成系统网络结构，以可控流体联系整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种实验分析功能的一种技术平台。微流控芯片以微流体控制为主，与目前生物科研领域常用的微阵列芯片有明显区别。微流控芯片中的流体是动态可控的，可以通过芯片的各种设计与控制，来调整反应物的量、反应时间以及流速、温度等其他条件。由于其在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，微流控芯片技术已经发展成为一个生表 和 的检测临床样本结果病原体结果 合计灵敏度特异性甲型流感病毒 合计 乙型流感病毒 合计 呼吸道合胞病毒 合计 腺病毒 合计 副流感病毒 合计 鼻病毒 合计 肺炎支原体 合计 物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。本研究对 例呼吸道感染患儿咽拭子样本进行 检测，与 检测试剂进行比较，评估甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒和肺炎支原体的 检测体系。结果显示种呼吸道疾病病原体 与 检 测 试 剂 阴 性 符 合 率 均 不 低 于；甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病中国实验诊断学 年月第 卷第期毒、鼻病毒和肺炎支原体阳性符合率（灵敏度）均不低于。本团队先前的研究结果显示，与直接免疫荧光法相比，检测乙型流感病毒、腺病毒和呼 吸 道 合 胞 病 毒 的 灵 敏 度 分 别 为 、，特异性分别为 、和 。本研究结果说明 在检测上述三种病毒的灵敏度上都有所提升。有研究指出与 检测相比，检测呼吸道合胞病毒的敏感性为 ，特异性为 ，本研究结果与其相似。等 人 的研究 表明 与 在检测呼吸道病毒方面具有高度一致性。本文建立的 方法在呼吸道病原体检测中具有与 相近的特异性，同时也有较高的灵敏度。相比于 检测平台自身的反应时间长、设备费用高等缺点，方法具有反应时间短、设备费用低的优点，是针对病原体靶基因核酸的更为高效和经济的快速检测手段。是一种新兴的分子诊断技术，将微流控芯片的微型化、高通量、低污染、低成本等优点与 技术的简便、快捷、高灵敏度等优点相结合，集成了一个新型的诊断技术，不仅可以实现核酸快速扩增，还可以降低对实验器材的依赖 。研究表明，在检测常见肠道致病菌方面表现出