消肿止痛合剂对大鼠皮瓣缺血..._NF-κB信号通路的影响_宋渊.pdf

第 卷第期 年月西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）（）本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版中医药研究消肿止痛合剂对大鼠皮瓣缺血再灌注损伤及 信号通路的影响宋渊，王海刚，何志军，刘涛，梁旭东，何元旭，沈稼轩，张团庄（甘肃省中医院手外二科，甘肃兰州 ；甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃兰州 ；甘肃省中医院足踝外科，甘肃兰州 ）摘要：目的观察消肿止痛合剂对大鼠皮瓣缺血再灌注损伤及 信号通路的影响。方法皮瓣术后观察各组大鼠背部皮瓣的存活情况及皮瓣存活率，用染色、染色及 法检测大鼠皮瓣血管内皮细胞中炎性因子的浸润程度、细胞核的破坏程度以及 、的分布特点及其 表达水平。结果术后假手术组皮瓣存活面积最大，模型对照组与 抑制剂组皮瓣存活面积最小；染色与 染色结果模型对照组与 抑制剂组大鼠皮瓣组织细胞破坏严重，可见明显凋亡细胞，模型组大鼠皮瓣组织细胞呈单层排列，细胞核完整，清晰；实验结果显示，与模型组相比，消肿止痛合剂组大鼠皮瓣组织中 、的表达被抑制（），而 的表达有所升高（），当加入阻断剂后，皮瓣组织中 、及 的表达进一步被抑制。结论消肿止痛合剂可以减少皮瓣缺血再灌注损伤大鼠模型中炎性细胞的浸润，减轻炎症反应，减少凋亡细胞的生成，进而减轻皮瓣的缺血再灌注损伤，并促进大鼠皮瓣的存活，其机制可能与抑制 信号通路有关。关键词：皮瓣；缺血再灌注损伤；消肿止痛合剂；信号通路；作用机制中图分类号：文献标志码：，（，；，；，）：，（），（）收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）（）通信作者：张团庄 ：网络出版时间：网络出版地址：期宋渊，王海刚，何志军，等 消肿止痛合剂对大鼠皮瓣缺血再灌注损伤及 信号通路的影响本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版 ，：；皮瓣移植技术作为显微外科及骨科领域的重要技术，已被广泛应用于整形外科等其他特殊领域。但皮瓣移植术后经常发生皮瓣坏死，有临床报道坏死率高达 。皮瓣的缺血再灌注损伤（，）是指缺血组织重新开放血流时，组织的缺血状态不但没有改善，损伤反而加重的现象。目前发现的与皮瓣缺血再灌注损伤相关的信号通路 主 要 有 、信 号 通 路，、都 属 于 的亚类，其中 信号通路被细胞内各种环境刺激及炎性刺激所激活，在皮瓣缺血再灌注损伤过程中发挥着重要作用。现代医学主要通过促进组织微血管再生、减轻组织炎症反应以及抑制细胞凋亡等手段来提高皮瓣存活率。但是中医药因其多中心、多靶点的作用，对治疗皮瓣缺血再灌注损伤具有独特的优势。课题组前期研究发现，消肿止痛合剂可明显降低软组织白细胞介素（）、肿瘤坏死因子（）等炎症因子的表达水平，在一定程度上阻止外伤后炎症介质的释放。本研究应用消肿止痛合剂，借助分子生物学技术，探讨皮瓣缺血再灌注损伤过程中 信号通路的作用机制，以期为活血化瘀类中药治疗皮瓣缺血再灌注损伤提供新的思路和方法。材料与方法材料实验动物选用 级 大鼠 只，雌雄各半，体质量为 ，由甘肃中医药大学实验动物中 心 提 供，分 笼 饲 养，饲 养 温 度 控 制 在 ，湿度控制在 ，定期进行实验室消毒，光照为 光照、黑暗昼夜交替循环，进行为期周 的 适 应 性 饲 养。动 物 合 格 证 编 号：；实 验 动 物 使 用 许 可 证 号：（甘）；实验动物生产许可证号：（甘）。甘肃中医药大学实验动物伦理审查委员会批准文号：。主要试剂消肿止痛合剂由甘肃省中医院制剂中心提供（批准文号：甘药制字 ；生产批号：）；（批号：）、（批号：）、（批号：）均购自 （中国上海）皓元生物科技有限公司；苏木素染液（批号：）、伊红染液（批号：）均购自上海碧云天生物技术有限公司；扩增试剂（批号：）、反转录试剂盒（批号：）均购自上海依可赛公司。方法实验分组采用随机数字表进行随机分组，将 只大鼠按体质量编号后随机分为组，组（模型对照组）、组（假手术组）、组（消肿止痛合剂组）、组（抑制剂组）、组（抑制剂组）、组（抑制剂组），每组各 只。动物造模术前灌胃及注射信号通路阻断剂，消肿止痛合剂组、抑制剂组、抑制剂组、抑制剂组给予消肿止痛合剂灌胃（），模型对照组、假手术组以同体积 氯化钠注射液灌胃；各组右下腹腔注射，抑制剂组以 （）注射，抑制剂组 （）注射，抑制剂组以 （）注射。设计皮瓣大小为 矩形随意皮瓣，皮瓣蒂位于尾端双侧髂嵴连线上，皮瓣纵轴与大鼠长轴平行，左右对称，沿设计画线行皮瓣手术，除假手术组外其余各组均行皮瓣缺血处理（皮瓣手术夹闭血管蒂）。动物取材在术后、，随机将大鼠麻醉后，切取皮瓣取出置于 冰箱中保存待用。术后形态学观察及皮瓣存活面积分别在术后、三个时相观察各组大鼠背部皮瓣的大体形态并采集图像，将采集到的照片输入到图像分析系统（）进行分析并计算皮瓣存活率，皮瓣坏死标准为：皮瓣表面痂皮形成、颜色变黑、质地变硬、无弹性。皮瓣存活率的计算公式如下：皮瓣存活率（）皮瓣存活面积 皮瓣总面积 。西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版染色将制作好的石蜡切片依次进行脱蜡、冲洗、切片水化，苏木素、伊红染色后的切片依次进入、的乙醇中各 进行切片脱水，再依次放入二甲苯一号、二甲苯二号各 进行切片透明，显微镜下观察并采集图像信息。染色同上述步骤制作石蜡切片，脱蜡、脱水，晾干后使用胰蛋白酶 试剂处理切片，将反应液滴加至切片上，盖玻片后固定后放置于湿盒内，保持湿盒内一定湿度，置于 恒温箱中孵育，洗涤，染色切片，苏木素复染，将染色后的切片依次进入、的乙醇中各 进行切片脱水，再依次放入二甲苯一号、二甲苯二号各 进行切片透明，中性树胶封片，显微镜下观察细胞并采集图像信息。检测将 保存待用的皮瓣组织加入裂解液裂解，然后将裂解液转移到去酶的 管内，在 管内依次加入氯仿及异丙醇，环境下置于离心机离心 （）后，弃去上清液，保留沉淀，待沉淀干燥后向管内加入不含 酶的水进行溶解，保存于 低温冰箱。逆转录合成，加入反转录试剂充分混匀。反应按照 试剂盒说明书进行操作，条件：预变性；变性，退火，个循环，每个循环，最后进行溶解。引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司提供，引物序列见表。表 引物序列 引物名称引物序列（）统计学分析采用 软件进行统计分析，数据中所有的计量资料以（?）表示，采用单因素方差分析进行组间比较。若方差齐符合正态分布，采用 进行组间多重比较；若方差不齐，不符合正态分布，采用 进行组间多重比较。符合正态分布的计量资料两组间的比较采用检验，为差异有统计学意义。结果大鼠形态学观察（图）术后：各组大鼠均存活，无死亡，麻醉剂效果逐渐消失，大鼠渐渐苏醒，各组大鼠均未见进食进水，皮瓣皮温较周围皮肤温度较低，皮瓣边缘见淤血肿胀，伤口未愈合，无出血及渗出，未观察到皮瓣明显坏死，各组间大鼠形态无明显异常。术后：各组大鼠全部苏醒且恢复饮食，组大鼠较组、组、组、组、组大鼠活跃，且进食进水量较多，皮瓣边缘未观察到明显的出血及渗出，各组大鼠肿胀较前均有消退，组和组大鼠皮瓣远端有少量坏死，其余各组大鼠触压皮瓣弹性良好，表面无黑色痂皮形成，判断无皮瓣坏死现象。术后：各组大鼠活动迅速，进食、进水量恢复正常，皮瓣存活部分与坏死部分界限清楚，皮瓣成活区域毛发的生长状况良好，皮瓣色泽红润，皮温正常，而坏死区域则见黑色痂皮形成，皮瓣皮肤失去弹性，皮温低于周围组织。组皮瓣坏死面积最大，组存活皮瓣面积最大，组和组大鼠皮瓣坏死面积明显大于其他组，组和组大鼠皮瓣存活面积无明显区别。各组大鼠皮瓣存活率的比较在术后、分别统计各组大鼠的皮瓣存活面积并计算皮瓣存活率（表）。术后，各组大鼠皮瓣存活面积无统计学差异（）。术后，与组比较，组及组大鼠皮瓣存活率明显较高，而组大鼠皮瓣存活率明显较低（）；与组相比，组和组大鼠皮瓣存活率明显较低（）。术后，与组相比，组、组、组、组大鼠皮瓣存活率均明显较高（），但与 组差异无统计学意义（）；与组相比，组、组大鼠皮瓣存活率均明显较低（）。表术后、组大鼠皮瓣平均存活率 （），（，）组别术后术后术后 与组（模型对照组）比较，；与组（假手术组）比较，。期宋渊，王海刚，何志军，等 消肿止痛合剂对大鼠皮瓣缺血再灌注损伤及 信号通路的影响本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版：模型对照组；：假手术组；：消肿止痛合剂组；：抑制剂组；：抑制剂组；：抑制剂组。（下同）图各组大鼠术后、皮瓣形态观察 ，大鼠皮瓣 染色的观察结果（图）术后：各组大鼠皮瓣组织结构排列整齐，细胞间有极少量炎性细胞存在，各组无明显差异。术后：组大鼠皮瓣组织排列紊乱，细胞核稀疏，可见明显水肿，组织间可见较多炎性细胞浸润；组大鼠皮瓣组织轻度水肿，见极少量炎性细胞浸润，其他皮瓣组织有轻微肿胀，但炎性细胞较组明显减少。术后：组大鼠皮瓣组织细胞排列紊乱，细胞核稀疏，大量白细胞浸润；组大鼠皮瓣组织细胞呈单层排列，结构整齐；组、组、组大鼠皮瓣水肿程度较轻，细胞结构较整齐，组织间隙可见少量炎症细胞浸润；组大鼠可见细胞结构排列无顺序，细胞核与周围胞质界限不清，细胞核可见部分破坏，细胞轻度水肿。大鼠皮瓣 染色结果 法染色结果如图和表所示，组大鼠皮瓣组织结构正常，核小体清晰、完整，仅有少量凋亡的细胞出现，分布在正常的结构周围；组和组、组大鼠皮瓣组织整体结构较完整、轻度水肿，细胞核清晰，少量凋亡细胞出现；组与 组皮瓣组织失去正常的组织结构，皮肤组织层次不清，大量凋亡的细胞出现，染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割、成块状和凋亡小体等典型的凋亡状态出现。实验结果术后：与 组相比，其他组大鼠皮瓣组织中 （、组）、（、组）的 表达量降低明显（，），的 表达量组最高，相对于组来说，、组 提 高 明 显（，），组 的 表达量低于 组，但并无统计学意义。与组相比，其他组大鼠皮瓣组织中 、的 表达量均有所升高，其中 的 表达量、组提高比较明显（，），而 的 表 达 量 明 显 下 降（，图）。西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版图各组大鼠术后 皮瓣组织 染色切片示例图（倍）（）表大鼠皮瓣组织内细胞凋亡百分率 （）组别 与组（模型对照组）比较，；与组（假手术组）比较，。期宋渊，王海刚，何志军，等 消肿止痛合剂对大鼠皮瓣缺血再灌注损伤及 信号通路的影响本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版蓝色为存活的细胞核，绿色为凋亡的细胞核。图各组大鼠皮瓣组织 法染色结果 术后：与组相比，其他组大鼠皮瓣组织中 、的 表 达 量 均 低 于组，的 表达量组最高，组次之（，），组 的 表达量虽低于 组，但并无统计学意义。与组相比，其他组大鼠皮瓣组织中 、的 表达量均有升高，其中 的 表 达 组 最 高，组 和 组 次 之（，），组、组表达虽有所提高，但并无统计学意义，的 表达量、组明显下降（，图）。术后：组大鼠皮瓣组织中 、的 表达量最高，组 的 表达量最高。与 组相比，组大鼠皮瓣组织中 、的 表达被抑制（）；当加入特异西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版性抑制剂 、后，可观察到 组、组大鼠皮瓣组织中 、的 表达进一步被 抑 制。相 较 于 组，组 大 鼠 皮 瓣 组 织 中 的 表达有所升高，但差异无统计学意义；当加入 信号通路抑制剂后，组大鼠皮瓣组织中 的升高趋势受到抑制。与组相比，其他组大鼠皮瓣组织中 、的 表达量有所升高，其中 的表达组最高，组和组次之（，），组、组表达虽有所提高，但并无统计学意义；的 表达组提高显著，组次之（，），组虽有提高，但并不明显；的 表达量其他组均明显下降（，图）。与组（模型对照组）比较，；与组（假手术组）比较，。图术后 各组大鼠皮瓣组织中 、的 表达水平 ，讨论皮瓣缺血再灌注损伤（，）广泛存在于皮瓣移植术后，常被认为是组织缺氧缺血恢复血供一系列动态变化过程，由于其损伤机制的复杂性及交互性，此类研究尚未取得突破性进展，如何治愈或彻底预防皮瓣缺血再灌注损伤至今仍是困扰临床医生的一大难题。近年来，中医药在治疗皮瓣缺血再灌注损伤方面取得了重大突破，某些具有活血化瘀功效的中药