外源褪黑素对鸡胚发育的影响研究_王宜.pdf

Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.6,2022.（Total No.232）2022 年第 6 期（总第 232 期）作者简介：王宜（1998），女，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种与繁殖，。#共同第一作者：张玉清（1999），女，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种与繁殖，。通信作者：杨彩侠（1975），女，教授，博士生导师，研究方向：动物遗传育种与繁殖，caixiayang 。相对于哺乳动物，鸡具有独特的生物学特性。鸡 ZW雌性胚胎性腺发育为不对称的卵巢，右侧的卵巢分化形成后在后续孵化期间逐步退化，只保留左侧卵巢继续发育，PGC 位于左侧卵巢的皮质区。反之，ZZ同型配子的性腺发育为双侧对称的睾丸。鸡为卵生，胚胎发育主要在体外，便于操作，易于获得，因此，是研究胚胎生物学和发育生物学的理想动物模型1。褪黑激素（N-乙酰-5-甲氧基色胺，Mela-tonin）是一种内源性胺类神经内分泌激素，主要在脊椎动物松果体中，由前体物质色氨酸经芳香氨基酸脱羧酶等的作用衍化生成，几乎存在于所有生物体内。在鸡胚孵化中，松果腺的发育始于孵化约 60小时，胚胎第 7 天出现可分辨的松果腺细胞2，胚胎第 10 天可测量到内源褪黑素3，胚胎第 13 天后，开始有节律地合成内源褪黑素4。褪黑素和 5-羟色胺可在禽蛋中形成一个弥散的神经内分泌系统，调节胚胎的发育和代谢事件5。褪黑素参与多种生理功能，除了调控生物节律和发育代谢外，还影响生殖、肿瘤和衰老等6。在啮齿类动物上，褪黑素降低雌性大鼠卵巢重量7,降低雄性仓鼠睾丸重量8。在鸡胚上，褪黑素信号影响眼和心脏的形态发生9，也拯摘要：为了探讨胚蛋注射褪黑素对 AA 肉鸡胚胎发育的影响，将 540 个种蛋在孵化第 2.5 天随机分成 6 组(每组 9 个重复，每个重复 10 个)，对照组正常孵化，开孔组不进行注射，其余四组分别开孔注射生理盐水、0.17 mol/L、1.7 mol/L和 17 mol/L的褪黑素，注射标准为 10L/蛋,出雏后检测胚蛋存活率、胚蛋重、出雏时间、出雏雏鸡重、雏鸡性别、雏鸡生殖器官长度和内脏器官重等指标。结果表明：(1)注射 1.7 mol/L(P0.01)或 17 mol/L(P0.001)褪黑素显著延迟雏鸡出雏时间；(2)注射 17 mol/L褪黑素显著降低雏鸡胰脏重(P0.05)。研究为深入探讨褪黑素影响动物胚胎发育的机理提供了一个模型。关键词：AA 肉鸡；褪黑素；开孔注射；种蛋孵化；胚胎发育doi:10.3969/j.issn.1006-4907.2022.06.011外源褪黑素对鸡胚发育的影响研究王 宜#，张玉清#，吴子薇，方 婷，杜志强，杨彩侠（长江大学 动物科学学院，湖北 荆州 434025）中图分类号：S831.5文章编号：1006-4907（2022）06-0029-05文献标识码：A官方兽医，专职从事动物检疫监督管理。县市农业综合行政执法局（队）负责动物防疫违法行为的查处和执法打击。3.2.3 县乡联动机制方面：建议以县市政府层面成立动物防疫议事协调机构，建立健全协调机制和会商机制，对县市直有关部门和乡镇政府在动物防疫防控、执法打击等方面进行统筹协调。3.3对工作保障的建议3.3.1 在组织保障方面：建议从上至下理顺管理体制，统一名称，明确职责，“三定”到位。乡镇实行定员定编定岗，严格招聘和选用专业人员。3.3.2 在经费保障方面：建议州、县、乡将动物防疫、检疫、执法、监测、监测以及应急处置等环节相关经费足额纳入同级财政预算，不足部分由中央和省财政按比例转移支付。另外，将村级动物防疫员劳务补助纳入特聘动物防疫员范畴。3.3.3 在技术保障方面：建议加大对基层动物防疫动物的技术培训力度，提高专业技术人员的能力和水平。3.3.4 在检查考核方面：建议将动物防疫工作纳入政府目标管理和绩效考核范畴，压实属地管理责任。参考文献：1 徐有均,王晔,郭海宏.动物防疫体系建设存在问题与建议J.畜牧兽医科学(电子版）,2020(17):135-136.2 曹建平,李小芳,蔡庆,等.对机构改革后如何完善基层动物防疫体系的思考J.湖南畜牧兽医,2021(4):41-42.3 雷志平.浅析娄星区乡镇动物防疫体系建设 J.湖南畜牧兽医,2019(4):46-47.4 李军,谭运华,陈红,等.湖南省基层动物防疫体系现状与建议J.畜牧兽医杂志,2019(6):79-81.收稿日期：2022-12-01试验研究29Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.6,2022.（Total No.232）2022 年第 6 期（总第 232 期）试验研究救低氧诱导的心血管发育异常10。然而，外源褪黑素对鸡胚孵化和器官发育的效应缺乏研究。本研究旨在通过向孵化 2.5 天的鸡胚卵黄囊内注射外源褪黑素，评价褪黑素对鸡胚孵化、生殖器官发育和重要内脏器官及肌肉发育的影响效应，为进一步深入研究提供参考。1 材料与方法1.1 试验材料获得、分组、开孔注射和孵化540 个 AA肉鸡种蛋购自汤阴县全达家禽育种有限公司。种蛋消毒、称重（532g），分成 6 组（正常对照、开孔、0.9%生理盐水、0.17 mol/L、1.7 mol/L、17 mol/L褪黑素），每组 9 个重复，每个重复 10 个，编号后放入孵化箱（科裕微电脑全自动孵化机）中孵化。孵化程序如下：17 天，温度参数 37.9，湿度参数 50%；814 天，温度参数 37.8，湿度参数 55；1517 天，温度参数 37.5，湿度参数 65；18 天之后，温度参数 37.2，湿度参数 70；孵化全程风机开启，灯开启。孵化 2.5 天，正常对照组继续孵化，其他五组经照蛋确定卵黄囊位置，75%酒精消毒后用迷你小电钻在气室端开直径 0.5 mm的圆孔（图 1），开口组不做注射，直接封口膜封口继续孵化，其他四组用1 mL注射器垂直向下分别注射 10 L的生理盐水，0.17 mol/L、1.7 mol/L、17 mol/L的褪黑素进入卵黄囊9，注射完毕后封口膜封口继续孵化，注射操作半小时完成。1.2 主要试剂主要试剂有：褪黑素（货号 M5250，Sigma），Trizol（货号15596026，Thermo），RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit（货号 K1622，Thermo），ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix（货号Q711-02，诺唯赞）。1.3 检测指标分别于孵化第 5 天、第 9 天和孵化第 13 天照蛋并剔除没受精的蛋，并称量活胚的蛋重。孵化第17 天称量活胚的蛋重。从孵化第 19.5 天开始每半天统计每组出雏雏鸡个数并称量出雏雏鸡重量，直到 22 天孵化结束。分别统计每组的出壳鸡个数、未出雏个数、出雏雏鸡性别。从每组出雏仔鸡中随机选取 10 个，分离并测量卵巢或睾丸长度，称量心、肝、脾、胰腺、胸肌、腿肌等重量。1.4 RT-qPCR 检测雏鸡卵巢抗氧化基因从 0.9%生理盐水、1.7 mol/L 和 17 mol/L 褪黑素组出雏雏鸡中随机选取 3 个，分离左侧卵巢，快速冻存于-80。Trizol 提取雏鸡卵巢总 RNA，检测 RNA 质量和浓度，1g RNA 反转为 cDNA。将cDNA 模板稀释 6 倍，用于荧光定量 PCR 扩增，反应体系为 10 L。设计鸡 Sod1、Sod2 和 Cat 的特异引物（表 1），送至上海生工生物工程有限公司合成，无酶水稀释引物至 100 mol/L，-20保存。10 L反应体系：5 L 的 2x ChamQ Universal SYBR qPCRMaster mix，3.6 L水，1 L cDNA，0.4 L 10 mol/L上下游引物。PCR 反应条件为：95 10min；9515 秒，60 60 秒，40 循环。每个样品设 3 个技术重复孔。Gapdh 作为内参基因，2-Ct方法计算表达量的变化。1.5 统计分析表 1 RT-qPCR 引物信息基因名GapdhSod1Sod2Cat基因 IDNM204305.1NM_205064.1NM_204211.1NM_001031215.2引物序列（5to3）F:5-TGTCAAGGCTGAGAACGGGAAAC-3R:5-AGATGATAACACGCTTAGCACCA-3F:5-CCAAAAGATGCAGATAGGCACG-3R:5-GCAGTGTGGTCCGGTAAGAG-3F:5-CCTGCCTTACGACTATGGCG-3R:5-AGCTGTAACATCACCTTTTGCC-3F:5-GGGGTTGTCTTTCCGACGTT-3R:5-TCAAGGCATCTGGCTTCTGAG-3产物长度（bp）188bp111bp151bp196bp图 1 种蛋开孔位置及大小30Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.6,2022.（Total No.232）2022 年第 6 期（总第 232 期）试验研究采用 SPSS 25 软件对数据进行统计分析，其中百分比数据，如孵化率、死亡率、性别比例采用卡方检验分析，其他数据均用单因素方差的 LSD 分析。试验数据以均值标准误表示。P0.05 时指示差异显著。注：同列数据肩注不同小写字母表示差异显著（P0.05），肩注不同大写字母表示差异显著（P0.01）。表 2 种蛋开口对孵化的影响胚胎重/g第 5 天49.280.9148.370.53第 9 天48.161.0747.580.50第 13 天47.041.0346.780.54第 17 天45.710.9845.880.57第 21 天36.730.5336.700.2355.92%：44.08%50.40%：49.60%性别比例20.57%A39.62%B死亡率79.43%a60.38%b孵化率对照开孔组别表 3 开孔对雏鸡出雏时间的影响对照开孔出雏个数19.5 天33组别20 天222020.5 天26821 天2621.5 天3122 天002 结果与分析2.1 种蛋开孔对鸡胚孵化的影响种蛋开孔组（气室端，直径 0.5 mm 的圆孔）的雏鸡孵化率（60.38%）与未开孔的正常对照组（79.43%）相比显著降低（P0.05），而种蛋开孔组的种蛋孵化死亡率（39.62%）比正常对照组（20.57%）显著增加（P0.05）。开孔组的雄雏比为 50.40%，雌雏比为 49.60%，而正常对照组雄雏比为 55.92%，雌雏比为 44.08%，两组之间没有显著的差异（P0.05）（表 2）。对于雏鸡的出雏时间，开孔组和正常对照组相比也没有明显差别（P0.05）（表 3）。对于雏鸡生殖器官长度和内脏器官重量，开孔组与正常对照组相比，卵巢长度、左侧睾丸长度、右侧睾丸长度、心脏重、肝脏重、胰脏重、胸肌重、左腿肌重、右腿肌重均无显著差异（P0.05）,但种蛋开孔孵化的雏鸡脾脏重量显著高于对照组（P0.05，表 5）。同样，对胚胎死亡率、孵化期的胚蛋重/雏鸡出雏重和雏鸡的性别比例在褪黑素处理组和生理盐水对照组之间也没有显著差异（P0.05，表 5）。而对于雏鸡出雏时间，0.17 mol/L褪黑素组与 0.9%生理盐水对照组相比没有显著变化（P0.05），1.7 mol/L 褪黑素组相对对照组出雏时间显著推后 0.5 到 1 天（P0.01），表 4 种蛋开孔对雏鸡生殖和内脏器官发育的影响注：同列数据肩注不同小写字母表示差异显著（P0.05），肩注不同大写字母表示差异显著（P0.01）。对照开孔组别左侧卵巢长度0.29170.0400.34620.055左侧睾丸长度0.35900.0550.34580.012右侧睾丸长度0.33780.0530.34610.012心0.32830.0120.31030.013肝0.80560.0430.76670.