小檗碱通过抑制肝星状细胞自噬改善小鼠肝纤维化_谭悦浩.pdf

Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期33网络出版地址：https：/ doi：10.3969/j.issn.1674-2257.2023.01.007论著小檗碱通过抑制肝星状细胞自噬改善小鼠肝纤维化*谭悦浩1，李灿2，邓峰美3，张嫔4，刘漪沦4，51.四川护理职业学院（成都 610100）；2.四川大学（成都 610000）；3.成都医学院（成都 610500）；4.雅安市名山区人民医院（雅安 625100）；5.成都医学院临床医学院第一附属医院 四川省老年医学临床医学研究中心（成都 610500）【摘要】目的研究小檗碱（BBR）对肝星状细胞（HSC）自噬与活化的调控及其抗肝纤维化作用。方法分别采用不同质量浓度BBR（0、2、5、10、20、50 mol/L）干预血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB，20 g/L）处理的LX-2细胞 24 h，使用CCK-8法检测细胞活力；采用不同质量浓度BBR（0、2、5、10 mol/L）干预PDGF-BB（20 g/L）处理的LX-2细胞 24 h或 48 h，使用 5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷（EdU）方法检测细胞增殖率，细胞划痕实验检测细胞迁移率。实时荧光定量聚合酶链式反应、免疫印迹法检测小檗碱（5 mol/L）对LX-2细胞-SMA，COL1A1 mRNA及蛋白表达的影响；检测Atg5、Becn1、Atg7、LC3、p62的表达。动物实验共 18只小鼠，随机分为 3组，对照组橄榄油（Oil）+磷酸盐缓冲液（PBS）、模型组四氯化碳（CCl4）+PBS和药物干预组（CCl4+BBR），每组 6只小鼠，造模 5周，2 次/周。第 3周开始给与BBR干预，2次/周，连续给药 3周。造模 5周后处死小鼠，检测各组小鼠肝脏组织中的羟脯胺酸水平，苏木素-伊红（HE）和天狼星红染色观察肝脏组织炎性细胞浸润及胶原沉积情况。结果BBR作用LX-2细胞 24 h的半数抑制浓度（IC50）为（31.512.66）mol/L；BBR可呈剂量依赖性地抑制LX-2细胞的增殖及迁移（P 0.05）。BBR（5 mol/L）下调LX-2细胞的-SMA、COL1A1 mRNA和蛋白表达水平，抑制细胞活化（P 0.05）。BBR（5 mol/L）下调LX-2细胞的Atg5 mRNA和蛋白表达水平，上调p62蛋白表达水平及减少LC3-/LC3-比值，抑制细胞自噬（P 0.05）。CCl4+BBR与CCl4+PBS组小鼠肝脏比较，BBR干预后，肝细胞脂肪变性坏死和炎性细胞浸润明显减轻，胶原纤维沉积减少，羟脯胺酸含量减少（P 0.05）。结论BBR在小鼠体内具有抗肝纤维化的作用，在体外可抑制LX-2细胞的增殖、迁移及活化，这可能与BBR抑制HSC 自噬水平有关。【关键词】小檗碱；自噬；肝星状细胞；肝纤维化【中图分类号】R575【文献标志码】ABerberine Relieves Liver Fibrosis in Mice by Inhibiting Autophagy of Hepatic Stellate Cells Tan Yuehao1，Li Can2，Deng Fengmei3，Zhang Pin4，Liu Yilun4，5.1.Sichuan Nursing Vocational College，Chengdu 610100，China；2.Sichuan University，Chengdu 610000，China；3.Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；4.People s Hospital of Mingshan District，Ya an 625100，China；5.Sichuan Clinical Research Center for Geriatrics，School of Clinical Medicine of Chengdu Medical College The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China【Abstract】ObjectiveTo study the regulation of berberine（BBR）on autophagy and activation of hepatic stellate cells（HSC）and its anti-fibrosis effect.MethodsLX-2 cells pretreated with platelet-derived growth factor-BB（PDGF-BB，20 g/L）were treated with different concentrations of BBR（0，2，5，10，20，50 mol/L）for 24 h，and the cell viability was detected by cell counting kit-8（CCK-8）.LX-2 cells pretreated with PDGF-BB（20 g/L）were treated with different concentrations of BBR（0，2，5，10 mol/L）for 24 h or 48 h，and the cell proliferation rate was detected by 5-acetyne-2 deoxyuracil nucleoside（EdU）method and the cell migration rate was detected by scratch test.The effects of BBR（5 mol/L）on mRNA and protein expressions of-SMA and COL1A1 in LX-2 cells were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（qPCR）and western blotting.The expressions of Atg5，Becn1，Atg7，LC3 and p62 were detected.*基金项目：雅安市科学技术局应用技术研究与开发项目（No：2020yyjskf05）；成都医学院研究生科研创新基金（No：YCX2020-14，No：YCX2020-25）通信作者：刘漪沦Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.1成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 1 期34肝纤维化是由于持续的肝脏慢性损伤和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积累所造成的结果，是多数慢性肝病共同的病理特征1。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纤维化形成的关键因素。各种因素导致HSC被激活，分化为肌成纤维细胞样细胞，同时向胞外分泌ECM，在肝纤维化的发展中发挥着至关重要的作用2。自噬是一个“自己吃自己”的过程，受损的细胞器和错误折叠的蛋白质被送入溶酶体进行降解，维持细胞的内稳态3。自噬在生物进化上高度保守，在生命活动中起着重要作用，同时也与许多人类疾病的发生发展有关4。研究5发现，HSC自噬水平的提高是其活化的重要因素，反过来通过抑制活化HSC的自噬，可抑制HSC活化、增殖，成为预防肝纤维化的有效治疗策略。小檗碱（Berberine，BBR）又称黄连素，广泛分布于黄连等各类药用植物中。BBR具有多种药理作用，在改善肥胖6、抗炎7、改善胰岛素抵抗8等方面有着不错的疗效。研究9-10证明，BBR可通过抑制细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，影响多种类型肿瘤细胞的活力，具有显著的抗肿瘤效果。在肝纤维化治疗方面，BBR可通过调节抗氧化系统和脂质过氧化作用，通过核因子B（nuclear factor B，NF-B）诱导细胞活化的HSC凋亡来改善实验性肝纤维化11-12。尽管BBR对肝纤维化有明显疗效，然而其具体的作用机制还未被完全阐明。因此，本研究旨在探索BBR对肝纤维化的作用及其分子机制，为肝纤维化防治提供药物开发的理论基础。1材料与方法1.1实验动物从成都达硕实验动物中心购买 18只 6周龄的雄性C57BL/6小鼠。所有小鼠饲养于成都医学院实验动物中心，每天给予光照 12 h，湿度为 5060，室内温度 1924，保证充足的水和饲料供应。实验操作符合成都医学院委员会标准。1.2主要试剂及仪器DMEM高 糖 培 养 基（BI，以 色 列），胎 牛 血 清（Cellmax，美国），抗COL1A1鼠单克隆抗体（Santa Cruz，美国），抗-SMA鼠单克隆抗体（Millipore，美国），抗p62、LC3B、ATG5兔 多 克 隆 抗 体（CST，美 国），抗GAPDH鼠单克隆抗体（Proteintech，武汉），血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）（Novus，美 国），1 mol/L Tri-Hcl pH=6.8，1.5 mol/L Tri-Hcl pH=8.8，Cy3-荧光二抗、羟脯胺酸检测试剂盒、5-乙炔基-2 脱氧尿嘧啶核苷（5-acetyne-2 deoxyuracil nucleoside，EdU）细胞增殖检测试剂盒（碧云天公司，上海）。1.3实验方法1.3.1LX-2培养及分组LX-2细胞系是由首都医科大学肝病研究所殷继亮教授赠送。LX-2细胞使用PDGF-BB（20 g/L）进行预处理，采用不同质量浓 度BBR的 5个 干 预 组（终 浓 度 分 别 为 2、5、10、20、50 mol/L）和加入不含有BBR的蒸馏水作为对照组。1.3.2BBR对LX-2 细 胞 增 殖 的 影 响96孔板中接种适当密度的LX-2细胞，按照“1.3.1”分组，分别加入含有相应质量浓度BBR的新鲜培养基，培养 24 hEighteen male C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups：control group n=6，Oil+phosphate buffer solution（PBS），model group n=6，carbon tetrachloride（CCl4）+PBS，and drug intervention group（n=6，CCl4+BBR），modeled for 5 weeks，twice a week.BBR intervention was started at week 3，twice a week for 3 weeks.After 5 weeks of modeling，the mice were sacrificed.The hydroxyproline content in the liver tissues of each group was detected.The inflammatory cell infiltration and collagen deposition in liver tissues were observed by hematoxylin-eosin（HE）and Sirius red staining.ResultsThe half maximal inhibitory concentration（IC50）of BBR on LX-2 cells for 24 h was（31.512.66）mol/L.BBR inhibited the proliferation and migration of LX-2 cells