向天果中柠檬苦素类化合物对...INS-1细胞保护作用研究_翟语桐.pdf

第 51 卷第 3 期2023 年 2 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.3Mar.2023向天果中柠檬苦素类化合物对氧化损伤下INS-1 细胞保护作用研究翟语桐,张刘颖,叶升敏,冯琛博,刁康阳,饶承钿,段静雨(徐州医科大学药学院,江苏省新药研究与临床药学重点实验室,江苏 徐州 221004)摘 要:为了探究向天果中 swietenine(Stn)及 swietenolide(Std)对氧化损伤下 INS-1 细胞保护作用。使用不同浓度的过氧化氢作用于 INS-1 细胞 4 h,CCK-8 法筛选出合适的造模条件;将向天果正丁醇层活性成分 Stn、Std 和阳性药格列齐特(Gli)作用于INS-1 细胞 24 h,CCK-8 法筛选出化合物的安全作用浓度;在过氧化氢损伤模型下,将化合物作用于 INS-1 细胞 24 h 后,分别检测细胞活力并计算细胞存活率和 ROS 水平变化;使用胰岛素 ELISA 试剂盒检测葡萄糖浓度分别为 3.3 mM 和 16.7 mM 刺激下的胰岛素分泌量,模拟 BIS 和 GSIS 下胰岛素分泌量。化合物 Stn、Std 可以提高氧化损伤下 INS-1 细胞的存活率,促进胰岛素分泌,降低 ROS 水平,促进细胞增殖,改善细胞凋亡状况。化合物 Stn、Std 可保护氧化损伤下 INS-1 细胞。关键词:向天果;氧化损伤;INS-1;swietenine;swietenolide中图分类号:TK224.1 文献标志码:B文章编号:1001-9677(2023)03-0104-04 基金项目:江苏省大学生创新创业训练计划项目(202210313096Y)。第一作者:翟语桐(2002-),在读学士。通讯作者:段静雨,博士,副教授,研究方向为中药活性物质筛选及中药药理学。Protective Effects of Swietenine and Swietenolide Isolated fromSwietenia Macrophylla King on INS-1 Cells Induced by Oxidative DamageZHAI Yu-tong,ZHANG Liu-ying,YE Sheng-min,FENG Chen-bo,DIAO Kang-yang,RAO Cheng-dian,DUAN Jing-yu(School of Pharmacy,Jiangsu Key Laboratory New Drug Research and Clinical Pharmacy,Xuzhou Medical University,Jiangsu Xuzhou 221004,China)Abstract:In order to explore the protective effect of Swietenine(Stn)and Swietenolide(Std)on INS-1 cells underoxidative damage,INS-1 cells were treated with different concentrations of hydrogen peroxide for 4 h,and the appropriatemodeling conditions were screened by CCK-8 method.Ins-1 cells were treated with Stn,Std and gliclazide(Gli)for 24 h.The safe concentration of the compounds was screened by CCK-8 method.Under the model of hydrogen peroxide injury,INS-1 cells were treated with the compound for 24 h,and the cell viability,cell survival rate and ROS level weredetected,respectively.Insulin secretion stimulated by 3.3 mM glucose and 16.7 mM glucose was detected by insulinELISA kit to simulate the insulin secretion under BIS and GSIS.The final results showed that compounds Stn and Stdcould improve the survival rate of INS-1 cells under oxidative injury,promote insulin secretion,reduce ROS level,promote cell proliferation,and improve cell apoptosis.Compounds Stn and Std could protect INS-1 cells from oxidativedamage.Key words:Swietenia macrophylla;N-butanol layer;swietenine;swietenolide向天果是楝科桃花心木属植物大叶桃花心木(Swieteniamacrophylla King)的果实,因其果实向天生长而得名1。马来西亚草药目录 中记载,向天果味苦、涩、性凉,解热、收敛2。当地百姓常将向天果煎煮服用来治疗糖尿病、高血压、高血脂等内分泌失调病症3。近几年国内外的研究表明,向天果具有治疗糖尿病的临床功效,同时还有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤的药理活性4。糖毒性是导致胰岛 细胞凋亡的直接原因,主要以葡萄糖毒性为主,促进 ROS 和一些糖基化终端产物葡萄糖胺的生成,从而出现胰岛 细胞表现出氧化应激的状态,导致胰岛 细胞功能的损伤,诱发凋亡,而线粒体在凋亡过程中起关键作用5。在线粒体凋亡通路中,抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白 Bax 是传递凋亡信号的关键蛋白,线粒体膜受损形成孔道导致释放其内部各种调控凋亡蛋白,氧化应激会上调促凋亡基因 Bax 表达,下调抗凋亡基因 Bcl-2 表达6,这些因素加剧了调控凋亡的相关蛋白从线粒体膜间隙释放,引发下游凋亡的级联反应,促使细胞凋亡7。因此,本实验以大第 51 卷第 3 期翟语桐,等:向天果中柠檬苦素类化合物对氧化损伤下 INS-1 细胞保护作用研究105 鼠 INS-1 细胞为基础建立氧化损伤模型。通过检测胰岛素分泌量、ROS 水平变化、细胞存活率等,探究向天果中柠檬苦素类化合物 swietenine 及 swietenolide 保护 INS-1 细胞的作用机制,为开拓抗型糖尿病药物研究提供实验依据和新方向。1 材料与仪器1.1 材 料实验中所用的材料 swietenine(Stn)及 swietenolide(Std)均为本实验室中分离得来,纯度大于 99.9%。1.2 仪 器实验中用到的主要仪器有:IX53 倒置显微镜,OLYMPUS公司;BX43F 正置荧光显微镜,OLYMPUS 公司;VE 180 Tanon垂直电泳系统,上海天能科技公司;164-5052 Western 电泳-转印电源,Bio-Rad 公司;170-3940 Bio-Rad 半干转印系统,Bio-Rad 公司;电泳仪,Hoefer 公司;凝胶照相分析系统,Bio-Rad公司。1.3 试 剂格列齐特(Gli),10 mmol/L PBS buffer,PBST 洗膜液等。2 实验方法2.1 H2O2诱导 INS-1 细胞氧化损伤条件的筛选及格列齐特(Gli)对 INS-1 细胞安全作用浓度的筛选本实验分组为 H2O2浓度组和空白对照组,同时每组设 5个复孔。使用酶标仪测定 450 nm 处吸光度 INS-1 细胞存活率计算:细胞存活率=(A空白-A加药)/A空白100%2.2 化合物 Stn、Std 对 INS-1 细胞低、中、高剂量的筛选化合物浓度设置为 2 M、5 M、8 M、10 M、15 M、20 M、30 M、40 M、50 M,方法同 2.1。2.3 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞存活率的影响本实验分为空白对照组、模型组、阳性药组、Stn 低、中、高剂量组、Std 低、中、高剂量组,同时每组设置 5 个复孔。加入终浓度为 10 M 的 Gli 为阳性药组,Stn 终浓度为:5、15、30 M,Std 终浓度为:5、20、50 M,每孔加入 100 L 培养液,空白对照组和模型组加入等量空白培养液,37,5%CO2,培养箱孵育 24 h;其余方法同 2.1。2.4 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞内ROS 水平的影响本实验分为空白对照组、模型组、阳性药组、Stn、Std 低剂量组、Stn、Std 中剂量组、Stn、Std 高剂量组,同时每组设置 5 个复孔。使用酶标仪测定荧光强度,488 nm 为激发波长,525 nm 为发射波长。2.5 化合物 Stn、Std 对氧化损伤下 INS-1 细胞胰岛素分泌量的影响本实验分为空白对照组、模型组、阳性药组、Stn、Std 低剂量组、Stn、Std 中剂量组、Stn、Std 高剂量组,同时每组设置 3 个复孔。按照大鼠胰岛素 ELISA 试剂盒(泉州睿信生物科技公司)的操作步骤进行胰岛素分泌量的检测;在 450 nm 波长处测定各孔的 OD 值;将测定的 OD 值代入标准曲线,计算各孔的胰岛素分泌量。3 结 果3.1 筛选 H2O2对 INS-1 细胞诱导损伤的条件如图1 所示,各个浓度下 H2O2对 INS-1 细胞在处理4 h 内细胞存活率的变化情况,以 50 1000 M 浓度的 H2O2处理4 h,50 200 M 浓度内细胞存活率下降平缓,并保持在 80%以上,在 200 500 M 浓度内细胞对 H2O2的浓度变化表现为十分敏感,细胞存活率急剧下降,细胞存活率迅速降至 20%左右,在 600 1000 M 浓度内细胞存活率下降平缓,推测在此浓度下细胞已经出现急性损伤导致死亡。最终选用 300 MH2O2处理 4 h 作为造模条件。图 1 不同浓度 H2O2处理下的细胞存活率Fig.1 Cell survival rate under different concentrations of H2O23.2 筛选格列齐特(Gli)对 INS-1 细胞的安全作用浓度如图 2 所示,2 50 M 下不同浓度的格列齐特作用 INS-1细胞 24 h 后,测得细胞存活率的变化情况,各个浓度下细胞存活率相较对照组均表现出显著性差异(P0.05),同时在2 50 M浓度下,细胞存活率均保持在 90%以上,可以说 2 50 M 为作用的安全浓度,且在 10 M 浓度下,细胞存活率出现了上升,最终选择 10 M 浓度为后续实验中格列齐特的作用浓度。图 2 不同浓度 Gli 处理后的细胞存活率Fig.2 Survival rate of cells treated with differentconcentrations of Gli3.3 筛选化合物 Stn、Std 对 INS-1 细胞的低、中、高剂量106 广 州 化 工2023 年 2 月如图 3 所示,2 50 M 不同浓度的 Stn 作用于 INS-1 细胞24 h 后,测得细胞存活率的变化情况。在化合物 Stn 的不同浓度下,细胞存活率均出现不同程度的提高,且相较于对照组均有显著性差异(P0.05),其中在 2 30 M 浓度内,细胞的存活率出现剂量依赖性的提高,故最终选择 5 M 为作用细胞的低剂量,15 M 为作用细胞的中剂量,30 M 为作用细胞的高剂量。图 3 不同浓度的 Stn 对细胞存活率的影响Fig.