响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究_郑舒怡.pdf

化学试剂 第 卷第 期分离提取技术编者按：本栏目由来自福建农林大学的青年编委卢旭副教授组稿，共收录 篇论文，主要涉及天然活性产物提取与分离技术应用及产物活性表征的内容。传统的有机溶剂已广泛应用于食品资源中各种生物活性成分的提取、分离和纯化，但依然存在提取得率低、处理步骤复杂、部分试剂存在毒性等问题。近年来一些新型绿色溶剂（如离子液体、超临界流体等）、新型提取模型（如响应面和神经网络等）与新型提取技术（闪式提取技术、超声微波联用提取技术、生物酶法提取技术等）被开发出来，并应用于提取、分离和纯化食品资源中的各种生物活性成分。提取分离方法的应用已引起医学、药学等领域专家的强烈兴趣，并为化合物结构与活性的基础研究发展作出了重要贡献。收稿日期：；网络首发日期：基金项目：国家自然科学基金面上基金项目（）；福建省对外合作项目（）；“中爱国际合作食品物质学与结构设计研究中心”项目（）；福建农林大学杰出青年科研人才计划项目（）；福建农林大学科技创新专项基金项目（，）。作者简介：郑舒怡（），女，福建泉州人，硕士生，主要研究方向为食品加工与营养。通讯作者：卢旭，：。引用本文：郑舒怡，左佳昕，戴鑫，等响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究化学试剂，（）：。响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究郑舒怡，左佳昕，戴鑫，高淑娟，张怡，卢旭，（福建农林大学 食品科学学院，福建 福州；福建省特种淀粉品质科学与加工技术重点实验室，福建 福州；中国爱尔兰国际合作食品物质学与结构设计研究中心，福建 福州；农业农村部亚热带特色果蔬菌加工重点实验室（部省共建），福建 福州）摘要：以薏苡仁为原料，选取酶解温度、料液比、淀粉酶添加量以及酶解时间 个因素进行单因素试验，利用响应面法建立数学模型，根据所得模型分析 个因素对寡糖得率的影响，最后对提取工艺进行优化。结果表明最佳工艺条件为：料液比.（）、酶添加量.、酶解时间.、酶解温度.，其中对薏苡仁寡糖得率影响最大的因素条件为酶解温度。在该条件下，薏苡仁寡糖得率为.，与模型预测值.接近，该工艺条件切实可行，可用于预测薏苡仁寡糖的提取。关键词：薏苡仁；寡糖；酶解；响应面；提取过程中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（，；，；，；，（），）：，.（），.，.，第 卷第 期郑舒怡等：响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究 .，.，.：；薏苡仁（），又称薏米、米仁等，是禾本利植物薏苡干燥后的成熟种仁。我国人工栽培的薏苡仁历史沉淀深厚、覆盖范围广，主要存在于辽宁、福建、江苏等地区。薏苡仁是传统药食两用植物，富含营养活性物质，其中淀粉含量为，蛋白质含量为.，脂肪含量为.，除此外还有类黄酮、多糖等营养物质。自古以来薏苡仁就有益脾、健胃、祛湿等功效。现代功能学研究显示其具有抗肿瘤、减脂降压、调节免疫功能等药理活性，临床上也将薏苡仁油作为主要原料用于抗癌治疗等药品。寡糖又称低聚糖，是由 个单糖分子通过，糖苷键连接而成的低度聚合糖，当寡糖本身被吸收时，会释放相当多的短链脂肪酸，调节肠腔的酸性环境，促进肠内矿物质吸收；同时，寡糖可以作为原料，通过葡萄糖苷酶的作用产生麦芽糖，可以转变成一系列非发酵性低聚糖，其不易被吸收，但可被双歧杆菌作用，有助其繁殖，有效阻止胃肠中有害微生物进一步增长，增强机体抵抗力；寡糖不易被链球菌发酵，且具有良好的防龋齿功能；此外寡糖具有的易降解和成膜性还可用于食品包装。寡糖的提取工艺包含酶解法、生物法、溶剂浸提法、超声波辅助法和蒸汽爆破技术等，。酶解法与其他的提取工艺相比条件温和、提取率高、成本低，且可以保持寡糖的功能性。此外微生物发酵法是一种利用酵母在生长过程中不能利用功能性寡糖，而除去小分子非功能性糖类，从而对薏苡仁寡糖起到去杂纯化效果。由于薏苡仁淀粉含量较高，因此可选用淀粉酶进行提取，酵母去除单糖和二糖，运用酶结合微生物发酵的方法，可以进一步提高提取寡糖的得率和抗消化性能。目前薏苡仁的提取研究主要集中在蛋白质、淀粉、多糖、油脂方面，发酵酶解法提取薏苡仁寡糖却鲜有报道，因此该实验可以为薏苡仁寡糖的综合利用提供依据。响应面设计法（，）将多元二次回归方法当作工具，估计函数，分析对等高线和函数的响应面，拟合响应面和各因子的函数关系，可以短期、有效、准确地处理大量数据，并在食品工艺设计中得到普遍应用。本研究以薏苡仁为原料，采用响应面法进行酶解提取寡糖，挑选最优提取工艺，优化薏苡仁寡糖得率。实验部分.主要仪器与试剂 型紫外可见分光光度计（北京市普析通用仪器公司）；型旋转蒸发器（上海市亚荣生化仪器厂）；型中草药粉碎机（天津市泰斯 特 仪 器 有 限 公 司）；目 试 验 标 准 筛（.，上虞市银河测试仪器厂）。苯酚、乙醇、浓硫酸、葡萄糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；酵母、淀粉酶（上海源叶生物科技有限公司，来源于米曲霉，比酶活力 ）；薏苡仁（福建省三明市杨晨食品有限公司）；实验室用水为二次蒸馏水。.实验方法.酶解提取薏苡仁寡糖的工艺流程参考文献的方法制备，薏苡仁打碎过 目筛加 水搅拌加.淀粉酶进行酶解 灭酶（）添加一定量的酵母进行酵解抽滤 进行真空浓缩（至 原体积）加乙醇进行沉降过滤真空浓缩（无醇味为止）定容至 稀释 倍（用 定容）测总糖（苯酚硫酸法）工艺要点如下：）酶解：下，薏苡仁粉水溶液加 淀粉酶酶解 ，酶解终点用碘试纸确定。）酵母：在 的条件下，加入原料质量 的酵母、的糖、倍酵母量的水（），经过活化 后进行使用（即先将.酵母、.葡萄糖、水混合后，置于 中进行复水活化 添加使用）。）醇沉降：将 倍用量的 乙醇加入提取液中，搅拌，于 的条件下进行沉降过夜（）。.薏苡仁寡糖含量的测定 支具塞试管（进行编号）分别加入.、化学试剂 第 卷第 期.、.、.、.、.对照品溶液加 水加 苯酚摇至均匀加 浓硫酸 摇至均匀 静放 水浴（，）冷却（至室温）测 值（）。结果得标准曲线公式为：.，用该吸光度计算样品中的寡糖含量和寡糖得率。寡糖得率（）葡萄糖浓度 定容体积 稀释倍数 （样品质量 ）测试时取 稀释样液、苯酚、浓硫酸，冷却，于 波长下测吸光度值。.单因素试验设计称取 薏苡仁干粉，固定 淀粉酶添加量.、酶解时间 、酶解温度 ，分别采用、（）料液比，按.和.中的方法提取样品溶液并测定其吸光度，考察不同的料液比对寡糖得率的影响。称取 薏苡仁干粉，固定料液比 （）、酶解时间 、酶解温度 ，分别采用.、.、.、.、.、.、.、.、.、.的酶添加量，按.和.中的方法提取样品溶液并测定其吸光度，考察不同的酶添加量对寡糖得率的影响。称取 薏苡仁干粉，固定料液比为 （）、淀粉酶添加量为.、酶解温度，分别采用、的酶解时间，按.和.中的方法提取样品溶液并测定其吸光度，考察不同的酶解时间对寡糖得率的影响。称取 薏苡仁干粉，固定料液比 （）、淀粉酶添加量.、酶解时间，分别采用、的酶解温度，按.和.中的方法提取样品溶液并测定其吸光度，考察不同的酶解温度对寡糖得率的影响。.响应面试验设计试验设计见表。表 响应面因素设计 料液比（）酶添加量酶解时间酶解温度.数据处理各试验做 次平行，结果取平均值；分别利用.、.软件，对试验数据进行分析，绘图和建立响应面模型。结果与讨论.单因素对测定薏苡仁中寡糖得率的影响.不同料液比对薏苡仁寡糖得率的影响从图 可以看出，寡糖得率随料液比提升而上升，可能是料液比提高，传质推动力上升，寡糖扩散过程增快；当其超过（）后，寡糖得率下降并逐渐趋于稳定，这可能由于酶与底物接触机会减少、细胞壁降解减弱，寡糖扩散减慢，并且料液比过大也会浪费溶剂不利实际生产以及后续浓缩，所以将料液比控制在 （）最适宜。图 料液比对薏苡仁寡糖得率的影响 .不同酶添加量对薏苡仁寡糖得率的影响由图 可知，随着酶添加量的增加，薏苡仁寡糖的得率稳步上升，在酶添加量为.时达到峰值，后寡糖得率呈现下降趋势，水解程度的增加可能使寡糖含量达到饱和状态，小分子低聚糖的水解属于多链式反应，水解到一定程度后低聚糖的水解速度变慢甚至有些低聚糖不能水解，所以 淀粉酶添加量为.最适宜。图 酶添加量对薏苡仁寡糖得率的影响 第 卷第 期郑舒怡等：响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究.不同酶解时间对薏苡仁寡糖得率的影响由图 可知，随酶解时间延长，薏苡仁寡糖得率逐步递增，但是当超过 后，寡糖得率逐渐趋于稳定，时间太短会提取不充分，甚至酶活性没被激活，时间增长薏苡仁颗粒已经充分溶胀，寡糖也得到充分溶出，但是时间的延长，部分溶液中的游离氨基酸可能与寡糖进行美拉德反应，使溶液变深，寡糖得率也会因此受到不良的影响，故酶解时间为 最适宜。图 酶解时间对薏苡仁寡糖得率的影响 .不同酶解温度对薏苡仁寡糖得率的影响从图 可知，酶解温度递增的同时，薏苡仁寡糖的得率逐步升高，为峰值，每种酶都有特定的最适温度范围，在此范围内酶活性与温度成正比，进一步促进体系的热运动，寡糖的得率增大，但是温度过高会破坏寡糖和酶结构，导致酶变性甚至失活，而且温度过高产品的品质也会有所下降，故 为最适宜酶解温度。图 酶解温度对薏苡仁寡糖得率的影响 .响应面法优化薏苡仁寡糖提取的工艺条件.响应面试验结果单因素试验分析结果显示，个因素对薏苡仁寡糖得率均有显著的影响效果。在此基础上，通过响应面探索薏苡仁寡糖提取的最佳条件，响应面试验设计及结果见表。表 试验设计及结果 试验号料液比（）酶添加量酶解时间酶解温度得率.模型方差分析以薏苡仁中寡糖得率为响应值，进行多元回归分析拟合，得到回归方程：.，回归模型方差分析结果见表。从表 可以看出 值、失拟差 值、拟合结果用系数（）、修正的关联系数（）、预测修正的关联系数（）和变化系数（）。回归模型 值小于.，表明回归模型极显著，且其失拟差 值为.，表明该模型有较高的拟合度，可以用来分析薏苡仁寡糖提取的工化学试剂 第 卷第 期表 回归模型的方差分析注 方差来源平方和自由度均方标准误差置信限低高 值 值显著性模型.残差.失拟项.纯误差.总离差.注：表示为极显著，表示为显著。艺参数。较高并不表示该模型为可靠的回归模型，也会增加模型中的变量，它与变量没有显著相关性。因此，可以选用 用于评估模型的可靠性。若项数或样本容量不够大，将明显小于。从表 可知，略小于，和之间存在的差异.，因此它们处于合理的波动范围内。表示标准误差与试验观察平均值的比值，以评估模型的再现性。若 大于，则平均值的变化程度太高，该模型的可靠性低；若 值较低，则表明平均值偏差程度较低，从而表明试验结果的可靠性高，由表 中的 值可知该模型准确可靠。越大，该因子作用效果越显著。通过表 可以看出，各因子影响程度为。偏回归系数中、为极显著，为显著，说明酶添加量、酶解温度对结果有极显著作用效果，酶解时间有显著作用效果；交互项均为不显著（.）说明交互项无显著作用效果；二次项中、的偏回归系数极显著，表明酶添加量、酶解温度对薏苡仁寡糖得率影响不存在简单的线性关系。.响应面结果分析响应面图是由响应值与各因子通过多元线性回归方程构成的曲面图，其坡度可以体现这一因子的作用程度，相互作用曲线越陡峭，则说明该因子对薏苡仁寡糖得率的影响越大，同时对于反应值的改变幅度越大，。变量间的交互作用程度可以通过其形状看出，其中椭圆形、马鞍形表示交互作用较强，而圆形则相反，极值存在的条件则在圆心处。由图 可知，在酶添加量.、酶解温度 时，薏苡仁寡糖得率达峰值，而后随酶添加量、酶解温度推移，薏苡仁寡糖得率减少。由图 可知，在酶解时间 、酶解温度 时，寡糖的得率达峰值，之后随酶解时间、酶解温度的增加，薏苡仁寡糖得率下降。图 可知，在酶添加量为.、酶解时间在 时，薏苡仁寡糖得率达峰值，之后随酶添加量、酶解时间的推移，薏苡仁寡糖得率减少。从图 可以看出，倘若另外 个因子不变，寡糖产量将随着时间的推移逐渐增加，表现为等高线之间的差距扩大，但趋势拐点不明显，相互第 卷第 期郑舒怡等：响应面法优化酶法制备薏苡仁寡糖工艺研究 图 酶解温度、酶添加量对薏苡仁寡糖得率影响的响应面图（）和等高线图（）（）（）图 酶解温度、酶解时间对薏苡仁寡糖得率影响的响应面图（）和等高线图（）（）（）叠加的影响不显著，表