新时期高校小动物活体光学成像系统的使用及管理_朱圆城.pdf

2023 年 13 期课 题 研 究高 教 学 刊Journal of Higher Education新时期高校小动物活体光学成像系统的使用及管理朱圆城，陈典华（南京大学/医药生物技术全国重点实验室，南京 210023）近年来，随着生命科学和生物医药研究等领域的蓬勃发展，模型动物实验受到科研人员愈发密切的关注。因此，以光学成像、核磁共振成像和计算机断层扫描成像为代表的小动物活体成像（In Vivo Imaging System，IVIS）技术应运而生1-2。该技术能够利用影像学的方法对活体、组织、细胞乃至分子水平的生物过程进行定性和定量研究。其中，基于光学成像原理的活体光学成像在肿瘤学基础研究和药物筛选中广泛使用，可以从整体水平上评估肿瘤的发展和药物的作用过程3。例如，在肿瘤研究方面可以长时间监测肿瘤生长及转移、抗肿瘤药物研发及癌症机理研究；在药物研究方面主要包括在活体动物水平进行药效评价，观测药物在活体动物体内的靶向、分布及代谢。随着“十四五”规划的开启和新 中华人民共和国科学技术进步法 的实施，对高校仪器平台的运行机制和技术人员的管理水平都提出了新要求4-5。小动物活体光学成像作为疾病动物模型研究的主流研究技术，是从分子、细胞及整体水平上研究疾病发病机理和病理生理过程的重要辅助工具，成为生命科学领域高频使用的实验仪器之一。本室配备 IVIS Lumina XR 和 IVIS Spectrum 两套活体光学成像系统，既能满足基本光学成像，又各具特色性功能，以下将从仪器使用和管理规范两方面分别进行介绍。一仪器介绍（一）基本原理小动物活体成像主要包括生物发光和荧光发光两种成像技术，采用高灵敏度制冷（-90）电荷耦合元件（Charge-Coupled Device，CCD）成像系统，研究模型动物体内相关基因的表达、肿瘤的生长/转移、疾病的发生和发展等生理过程6-7。摘要：当今生命科学与医学的飞速发展很大程度得益于模式动物可以模拟人体的生理和病理特征。小动物活体光学成像系统作为生物医学和生药学领域的重要研究手段，利用灵敏的光学检测技术，能够对生物体内的细胞/基因行为进行实时、无创监测，对疾病的发生发展、临床诊疗及药物研发具有重要指导价值。“十四五”规划伊始，基础科学研究面临新需求，挑战与机遇并存。以南京大学医药生物技术全国重点实验室配备的小动物活体光学成像系统为例，结合社会发展新形势和疫情防控常态化的现状，首次从仪器使用和仪器管理两方面进行综合性阐述，以期对高校仪器平台中该类仪器的高效利用和规范管理提供新思路。关键词：新形势；高校；小动物活体光学成像；高效利用；规范管理中图分类号：G647文献标志码：A文章编号：2096-000X（2023）13-0068-04Abstract:Nowadays,the rapid development of life science and medicine is largely benefit from the fact that experimental animalmodels can simulate the physiological and pathological features of human body.As an important research instrument,in vivo opticalimaging system for small animalsplays a prominent role in the field of biomedicine and pharmacognosy.Via using sensitive opticaldetection technology,relevant cell/gene behaviors in living organisms can be monitored in real-time and non-invasively,whichpossesses conducive significance for the occurrence and development of diseases,clinical therapy and drug discovery.At the primarystage of The Fourteenth Five-Year Plan,fundamental scientific research is facing new requirements with both opportunities andchallenges.Herein,taking the in vivo optical imaging system equipped in the State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnologyas an example,a comprehensive exposition has been made from both the utilization and management of the instrument for the firsttime.Under the current situation,the study hopes to provide new insights for the effective utilization and standardized management ofthe above instruments in many other colleges and universities.Keywords:new era;colleges and universities;in vivo optical imaging system;efficient utilization;standardized management基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目“集成化有机光-电化学晶体管生物传感新方法研究及应用”（2021101616）第一作者简介：朱圆城（1993-），女，回族，河南周口人，博士，工程师。研究方向为生物传感新方法研究、实验室仪器开发与管理。DOI：10.19980/j.CN23-1593/G4.2023.13.01768-课 题 研 究高 教 学 刊Journal of Higher Education2023 年 13 期实验室研究中，一般选用荧光素酶基因标记细胞或DNA 实现生物发光。通过腹腔或静脉注射荧光素底物，该底物能在荧光素酶的催化下消耗腺苷三磷酸（ATP），并与氧气发生反应产生激发态的氧化荧光素，氧化荧光素从激发态回到基态时释放光子从而发光，是化学能转化为光能的过程。荧光成像主要采用荧光报告基团标记细胞或 DNA，当荧光物质受到合适波长的光激发后，电子被激发到高能级，随后向低能级跃迁的过程中产生比激发光波长更长的荧光，是物理过程。目前，常用的活体荧光标记物有荧光蛋白、荧光染料和量子点等。相较于生物发光成像，荧光成像前无需注射荧光素酶底物，实验成本低，过程简单；信号强度高，持续时间久，对 CCD 的灵敏度要求相对低；标记能力更强，可对样本进行多色标记，同时获得多种细胞或药物的分布；生物发光只能在活细胞内发光，而荧光蛋白或荧光染料则可以实现对活体或离体组织器官的监测。尽管荧光信号远高于生物发光，但由非特异性荧光产生的背景噪音大大降低了其信噪比。相比之下，生物发光成像以荧光素酶作为活体信号报告源，无需外源性激发光，有效提高了信噪比和灵敏度，避免了对正常细胞的损伤，便于长期对生物体进行观察。此外，生物发光具有背景信号低、穿透力强的特点，更适用于对较深组织的研究。（二）功能介绍IVIS Lumina XR 是一种二维多模式活体成像系统，具备生物发光、多光谱荧光和 X 光活体成像功能。依托多达 26 个滤光片的配置，使用者可对从绿光到近红外的几十种荧光探针进行成像。IVIS Spectrum 除具备生物发光成像、多光谱荧光和光谱分离成像功能外，还能实现生物发光和荧光三维成像功能，能够和其他模式的三维影像系统（如磁共振成像 MRI、电子计算机断层扫描 CT 等）联用，同时实现功能性成像与结构性成像。近年来，借助 IVIS 的上述卓越性能，科研人员开展了一系列的实验工作。例如，随着 SARS-CoV-2 的传播，出现了毒性和传播性更强的变异株 Alpha、Beta 和 Gamma。为研究已感染个体是否会再次感染、变异株是否会对现有疫苗产生免疫逃逸，研究者构建了相应的动物模型，辅以 IVIS 检测技术，对感染和免疫逃逸机制进行了探究8。2022 年 3 月，复旦大学报道了一种抗新冠病毒的广谱双特异性全人源纳米抗体，对药物进行荧光标记，分析了小动物活体内药物的分布与靶向情况9。二仪器使用（一）基本参数Living Image 软件是小动物活体图像获取的重要途径，通过该软件进入控制面板（图 1）界面，包括成像方式、曝光时间和视野范围等参数，相关设置会直接影响图像质量。图1IVIS控制面板界面1成像方式（Imaging Mode）成像方式主要包括生物发光（Luminescent）和荧光（Fluorescent），可根据实验需求进行选择。进行生物发光成像时，保持发射滤光片（Emission Filter）处于 Open 状态即可；当进行荧光成像时，要选择与荧光标记物相匹配的激发滤光片（Excitation Filter）和发射滤光片（Emission Filter）方可获取荧光信号。2曝光时间（Exposure Time）曝光时间决定了信号强度，曝光时间越长，信号强度越高，可根据实验需求进行设置。对初次实验或不确定曝光时间的情况，可选择 Auto，仪器会自动匹配合适的曝光时间进行成像。如遇信号较弱成像不佳，可适当增加曝光时间以提高信号强度。3视野范围（Field of View）可用于调节观察视野的大小，共有 A/B/C/D 四个选项，从 A 到 D 视野范围依次变大，实验时可根据单次观察样品（染料、细胞和小鼠等）的大小和个数选择合适的视野范围。此外，控制面板上的 Binning 值代表像素值，光圈大小（F/stop）决定了光的透过量，成像聚焦（Focus）包含自动聚焦和手动聚焦功能。（二）实验动物前处理1模型动物构建该过程主要是根据实验需求，将已标记的细胞或组织通过尾静脉注射、皮下移植和原位移植等方法进行接种，随后在合适的成像模式下完成图像的采集。为减少非特异性信号的干扰，在进行活体成像前，建议将实验动物69-2023 年 13 期课 题 研 究高 教 学 刊Journal of Higher Education进行完全脱毛或对检测部位进行局部脱毛；如荧光信号较弱，可尝试用黑纸板将产生干扰信号的部位遮住后拍摄；检测肿瘤转移等较弱的生物发光信号时，需要把较强的原位肿瘤信号遮住，以便获取更佳的动态信号。2麻醉剂选择合理的麻醉是动物实验顺利进行的先决条件，基于动物伦理和动物福利要求，合理选择麻醉剂十分必要10。实验动物常用的麻醉剂主要包括注射用麻醉剂和吸入性麻醉剂。注射用麻醉剂指的是经静脉、皮下和肌肉等途径注射能够产生麻醉作用的药物，其优点是不依赖昂贵的设备，麻醉过程平稳，一次给药可维持较长时间。但该类麻醉剂须经肝脏代谢后动物方能苏醒，且麻醉程度不易控制。吸入性麻醉剂是一类挥发性液体或气体，经过肺泡动脉进入血液，随血液循环透过血脑屏障，从而阻断神经传递功能。与注射式麻醉相比，动物的麻醉速度和恢复速度更佳，麻醉深度可控，更具安全性。因此，在动物实验开始前，应预先了解各种麻醉剂的作用机制和毒副作用，科学地选择麻醉剂。（三）实验拍摄步骤打开 Living Image 软件，点击 initialize 仪器开始初始化，待 CCD 和样品台温度满足实验需求后，设置相关实验参数，点击 Acquire 获取图片。1生物发光及荧光二维成像对于生物发光成像，同时勾选 Lumin