新城疫病毒Mukteswar株反向遗传平台的建立_魏家阳.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):3 0-3 5P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e新城疫病毒M u k t e s w a r株反向遗传平台的建立 收稿日期:2 0 2 2-0 1-1 4 基金项目:国家自然科学基金项目(3 1 8 7 3 0 1 8);国家现代农业产业技术体系建设专项资金(C A R S-4 1-G 1 3);湖北省自然科学基金重点类项目(2 0 2 1 C F A 0 1 9);湖北省科技创新项目重大专项(2 0 2 0 A B A 0 1 6);湖北省农业科技创新中心重大科技研发(2 0 2 0-6 2 0-0 0 0-0 0 2-0 1)作者简介:魏家阳(1 9 9 6-),女,湖南长沙人,硕士,主要从事新城疫病毒分子生物学研究。*通讯作者魏家阳1,2,李 丽2,王国康2,徐英英2,曾 哲2,罗青平2,邵华斌2,温国元2,商 雨2*,潘兹书1*(1.武汉大学生命科学学院,湖北武汉4 3 0 0 7 2;2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室,畜禽病原微生物学湖北重点实验室,湖北武汉4 3 0 0 6 4)摘 要:为了建立新城疫疫苗株M u k t e s w a r株的反向遗传操作系统,根据M u k t e s w a r株的基因序列设计了9对引物,扩增获得基因组片段,通过O v e r l a pP C R和I n-F u s i o n无缝克隆的技术,将9个片段拼接和插入至p A C N R-T 7中,获得了M u k t e s w a r株全长c D NA克隆质粒p A C-M u k t e s w a r。将其和3个辅助质粒(p VA X-N P、p VA X-P和p c D NA-L)共转染至预先感染了痘病毒v T F 7-3的B HK-2 1细胞,成功拯救出重组病毒r M u k t e s w a r。对r M u k t e s w a r的生长曲线、最小致死剂量的平均致死时间(MD T)等生物学特性进行测定,结果显示r M u k t e s w a r具有和野生株相似的增殖特性和毒力。成功建立了新城疫疫苗株M u k t e s w a r的反向遗传操作系统,为研发高效率表达外源病原体蛋白的新城疫载体疫苗奠定了基础。关键词:新城疫病毒;M u k t e s w a r株;反向遗传操作系统中图分类号:S 8 5 2.6 5 9.5文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 3 0-0 6 新城疫病毒(N e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s,N D V)是一种以禽类作为宿主的R NA病毒,其基因组为单股、负链、不分节段的R NA1。N D V按照毒力可以分为强毒株、中等毒力毒株和弱毒株。弱毒力毒株可在家禽体内有限复制,并能刺激系统免疫反应,可开发为活疫苗应用于新城疫的防控。随着反向遗传学技术的发展,体外操作N D V的基因组很容易实现,N D V被开发成载体应用于基因工程疫苗的研究。以N D V为载体开发基因工程疫苗有很多优势:安全性高,N D V在宿主的细胞质内复制,且病毒的生活周期中不会出现D NA,因此,病毒的基因组与宿主基因组重组的概率极低;生产成本低,N D V可在鸡胚内增殖很高的滴度;免疫方式多样,可以采用滴鼻、点眼、喷雾和饮水等多种方式免疫;免疫保护效果好,N D V可以刺激机体产生多种免疫反应,包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫;遗传稳定性好,多个研究表明外源基因的插入不影响N D V的稳定性,而且多代次传代后的病毒能很好地表达外源基因。因此,在N D V反向遗传学平台被建立以来,大量的基因工程疫苗被研究和评估2-3。另外,由于N D V具有严格的宿主限制性,能够进入大多数哺乳动物细胞(包括人类细胞)以及肿瘤细胞,但不能在细胞内复制,同时哺乳动物(包括人类)不存在针对N D V的预先免疫,因此,N D V可应用于预防哺乳动物传染病或治疗人类的相关疾病4。常用于疫苗载体的N D V包含L a S o t a、C l o n e-3 0和T S 0 9-C等弱毒株5-7。以N D V中等毒力毒株B C株和弱毒株L a S o t a株为载体,构建表达人副流感病 毒3型(H u m a np a r a i n f l u e n z av i r u st y p e3,H P I V 3)HN蛋白的重组新城疫病毒N D V-B C/HN和N D V-L S/HN;感染D F-1细胞2 4h,其中N D V-B C/HN的H P I V 3 HN mR NA表达水平明显高于N D V-L S/HN或野生型H P I V 3;动物试验结果显示,N D V-B C/HN免疫效果较好,诱导产生的抗体水平高于N D V-L S/HN组8。以上结果表明,中等毒力的N D V为载体构建的重组N D V可以快速和高效表达外源蛋白,刺激机体产生较强的免疫反应。另外,随着外源基因的插入,病毒基因组的增大,病毒的复制效率降低,以弱毒株为载体的重组病毒感染能力进一步下降,从而影响到免疫效果9。因此,为了提高N D V载体疫苗的免疫效果,可以尝试更多以中等毒力N D V为基础的载体疫苗的研发。本研究以N D V M u k t e s w a r中等毒力株为研究对象,构建了该毒株的反向遗传学操作平台并拯救DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.026出了M u k t e s w a r株病毒,对该病毒的生物学特性进行了测定。N D V M u k t e s w a r株反向遗传学平台的建立,可为研制高效表达外源病原体免疫蛋白的新城疫载体疫苗奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂 病毒基因组提取试剂盒,A x y g e n公司产品;2P h a n t aM a xM a s t e rM i x(D y eP l u s)、2 R a p i dT a qM a s t e rM i x、反转录试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品;D p nI、I n-F u s i o nHDC l o n i n gK i t,宝生物工程(大连)有限公司产品;胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒,美国Om e g a公司产品;无 内 毒 素 质 粒 提 取 试 剂 盒、胎 牛 血 清 和DMEM培养基,赛默飞世尔生物化学制品有限公司产品;F I T C标记的羊抗鸡I g G抗体,北京博奥森生物技术有限公司产品。1.1.2 仪器设备 P C R仪,美国T h e r m oF i s h e r公司产品;凝胶成像系统,上海勤翔科学仪器有限公司产品;隔水式电热恒温培养箱,武汉市方正仪器设备有限公司产品;鸡胚孵化机,山东德州利民孵化机研制中心产品;C O2培养箱,美国S HE L-L A B公司产品;倒置荧光显微镜,日本O l y m p u s公司产品。1.1.3 细胞、病毒和质粒、鸡胚 大肠 埃希氏菌DH 5 感受态细胞,宝生物工程(大连)有限公司产品;B HK-2 1细胞、重组牛痘病毒(v T F 7-3)、N D V-M u k t e s w a r株尿囊液、p A C N R-T 7载体,辅助质粒p c D NA-L、p VA X-N P、p VA X-P质粒,由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室构建并保存;S P F鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。1.2 方法1.2.1 N D V M u k t e s w a r株基因组的提取和c D NA的制备 取2 0 0L N D V M u k t e s w a r株病毒尿囊液,按照病毒基因组提取试剂盒说明书进行病毒R NA提取,提取的R NA用3 0L无R NA酶水洗脱。再按照反转录试剂盒说明书的步骤,将R NA反转录成c D NA,冻存于-8 0备用。1.2.2 N D V M u k t e s w a r株全长c D NA克隆的构建 以N C B I上公布的N D V M u k t e s w a r株的序列(G e n B a n k登录号为:J F 9 5 0 5 0 9.1)为参考,设计9对引物(A 1-F&A 1-RA 9-F&A 9-R)(表1),相邻的扩增片段间设计有3 0b p5 0b p的重叠序列,第1个片段的上游引物和第9个片段的下游引物带有1 5 b p的载体锚定序列。以M u k t e s w a r株c D NA为模板,扩增9个小片段A 1-A 9,以A 1、A 2和A 3的P C R回收产物为模板,A 1-F和A 3-R为引物,通过O v e r l a pP C R的方法获取融合片段B 1,融合片段B 2和B 3以相同的方法获得。另设计了一对引物(V-T 7 F,V-T 7 R)用于载体线性化。首先通过I n-F u s i o n无缝克隆的方式,将融合片段克隆至p A C N R-T 7中,获得质粒p A C N R-B 1,经酶切鉴定和测序正确后,依次将融合片段B 2和B 3插入载体质粒中,最终获得全长克隆c D N A质粒p A C-M u k t e s w a r(图1)。图1 N D VM u k t e s w a r株感染性克隆的构建策略F i g.1 C o n s t r u c t i o ns t r a t e g yo f i n f e c t i o u sc l o n eo fN D VM u k t e s w a r s t r a i n表1 构建过程中所用的引物T a b l e1 P r i m e r s f o r c o n s t r u c t i o n引物名称P r i m e rn a m e引物序列5 -3 P r i m e r s e q u e n c eV-T 7 Fg g g t c g g c a t g g c a t c t cV-T 7 Rc c t a t a g t g a g t c g t a t t a c g c g gA 1-Fa c g a c t c a c t a t a g ga c c a a a c a g a g a a t c c g t g a g a t a c gA 1-Ra g g t t a c a g g c a g a a g a a t c g a g a t g aA2-Fa a t c a t c t c g a t t c t t c t g c c t g t a a cA2-Rg a g g c g g g a g a a g g t t a t c g c t tA3-Fg c g a t a a c c t t c t c c c g c c t c tA3-Ra g a g a a c t t g t c a g a c g g a c a t a a c t cA4-Fc t g a g t t a t g t c c g t c t g a c a a g t t c tA4-Rc t t t t g t t c a c c t a c a t c c g g t a g t t t t t tA5-Fa g a a a a a a c t a c c g g a t g t a g g t g a a c aA5-Rg t a a g g g g a c a a t t c t g a a t t c c c c gA6-Fc g g g g a a t t c a g a a t t g t c c c c t t aA6-Rt g c t c a g a t t g g t g a c a g g g t c a tA7-Fa a t a