纤维素酶提取南靖金线莲多糖的工艺优化_林艺华.pdf

2023，32（1）福建分析测试Fujian Analysis&Testing纤维素酶提取南靖金线莲多糖的工艺优化林艺华1，肖海英2，林姿羽1，林美珍1*（1.漳州卫生职业学院，福建漳州363000；2.南安市仑苍镇卫生院，福建泉州362304）收稿日期：2022-8-16基本项目：漳州市自然科学基金项目（ZZ2020J07）；漳州卫生职业学院科技创新团队培育项目（Kjcx-3）作者简介：林艺华（1982），女，副教授，研究方向：天然药物化学成分提取分离与成析，Email：通讯作者：林美珍（1965），女，教授，研究方向为药用植物学。E-mail：摘要：目的：考察并优化纤维素酶提取南靖金线莲多糖的工艺参数，建立生物酶提取金线莲多糖的方法。方法：采用酶提醇沉法提取、Savege法纯化金线莲多糖，并应用紫外-可见分光光度法检测金线莲多糖含量。通过试验考察酶添加量、酶解时间、PH缓冲液、酶解温度、料液比等对纤维素酶提取金线莲多糖效果的影响，选取各因素的最优试验范围，对纤维素酶提取金线莲多糖工艺进行优化。结果：金线莲多糖纤维素酶提取最佳条件为：酶添加量为5.0mL、酶解时间180min、PH6.6缓冲液、酶解温度65、料液比1：30。在最优提取工艺条件下，金线莲多糖提取率为20.93%。结论：本方法操作简单，快速，重复性好，可为生物酶提取金线莲多糖成分有效利用提供依据。关键词：南靖金线莲；纤维素酶；多糖；提取中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1009-8143（2023）01-0054-05Doi:10.3969/j.issn.1009-8143.2023.01.11Optimization of cellulase extraction technology of polysaccharides fromNanjing Anoectochilus roxburghiiLin Yi-hua1，Xiao Hai-ying2，Lin Zi-yu1，Lin Mei-zhen1*（1.Zhangzhou Health Vocational College，Zhangzhou，Fujian 363000，China；2.Luncang Town Hospital，Nan an City，Quanzhou，Fujian 362304，China）Abstract:Objective：The technological parameters of cellulase extraction of Nanjing Anoectochilus roxburghii polysaccharide were optimized，and the method of enzymatic extraction was established.Methods：The polysaccharide of Nanjing Anoectochilus roxburghii was extracted by enzyme extraction and alcohol-precipitation method，purified by Savege method，and its content was detected by Uv-vis.The effects of enzyme dosage，enzymolysis time，PH buffer，enzymolysis temperature and solid-liquid ratio on the extraction of efficiency of Anoectochilus roxburghi polysaccharide by cellulase were investigated，and the optimum experimental range of each factor was selected to optimize the extraction process of Anoectochilus roxburghii polysaccharide by cellulase.Results：The optimum conditions for cellulase extraction of polysaccharides fromAnoectochilus roxburghii were as follows：5mL enzyme dosage，180min enzymolysis time，PH6.6 buffer，65 enzymolysistemperature，and solid-liquid ratio of 1：30.Under the optimum extraction conditions，the extraction rate of polysaccharidesfrom Anoectochilus roxburghii was 20.93%.Conclusion：The method is simple，rapid and reproducible，which can providea basis for the effective utilization of polysaccharide components extracted from Anoectochilus roxburghii by biological enzyme.Key words：Nanjing Anoectochilus roxburghii；cellulase；polysaccharide；extract542023，32（1）金线莲为兰科开唇兰属金线兰 Anoectochilusroxburghii（wall）Lind1.，别名：花叶开唇兰、虎头蕉、鸟人参、金石松、金不换等，主要分布在福建、广东、广西、江西、云南、台湾等地1。金线莲全草均可入药，性平、味甘、微苦，具有清热凉血、祛风利湿、平衡阴阳、扶正固本、生津养颜、润肺止咳、消肿解毒、止血降压、强心利尿等功效，享有“药王”、“金草”之美称2。金线莲为药食两用植物，在民间食用历史悠久，人们常用来煲汤或做成药膳食品等，尤其是在闽南、台湾等东南亚地区，当地居民把它当作神草。金线莲富含多糖、黄酮、甾体化合物、萜类化合物、氨基酸、有机酸、微量元素等多种成分，其中多糖是主要活性成分，具有调脂保肝、抗氧化、免疫调节、降血糖、抗炎、抗肿瘤等多种药效作用3。因此，金线莲多糖的保健功能受到越来越多学者关注。目前对金线莲多糖的提取包括溶剂提取法、稀酸提取法、碱液提取法、超声提取法、微波提取法、酶提取法等工艺4，其中酶提取法报道较少，酶提取法是利用生物酶破坏细胞结构，从而促使细胞内容物中化学成分释放出来的方法，具有高效、特异性强、操作流程简便、条件温和等优点5。因此本研究采用纤维素酶在实验优化条件下提取金线莲多糖，以期为后续生物酶提取金线莲多糖成分有效利用提供依据。1材料及仪器金线莲（福建省漳州市南靖草本养生生物科技有限公司），经鉴定，为兰科开唇兰属金线兰的干燥全草。葡萄糖标准品（北京索莱宝），纤维素酶（罗恩）、无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司出品；Lambda12紫外-可见分光光度计，BS110S电子天平，高速振荡器，数显恒温水浴锅，B600型低速自动平衡离心机等。2实验方法2.1金线莲粗多糖的提取6将预处理过的干燥金线莲粉碎，过100目筛，精密称取1.00g，加入不同体积的酶溶液，用不同PH缓冲液补至适量，分别在不同料液比、提取温度、酶解时间等条件下进行提取，提取后于100水浴中加热20min灭酶活性，冷却后，转移至离心管中4000r/min离心20min，取上清液，加4倍量无水乙醇，4静置过夜，得到粗多糖沉淀。2.2金线莲粗多糖的纯化将上述得到的粗多糖沉淀加适量蒸馏水溶解，采用Savege法7除蛋白，按照粗多糖溶液：Savege试剂（三氯甲烷：正丁醇=4：1）=5：1（v：v）的比例，混合后于振荡器强烈振荡20min，3000r/min离心10min，收集上清液，重复上述操作至少三次，直到没有明显的蛋白层出现，得到金线莲多糖样品溶液。2.3金线莲多糖的含量测定金线莲多糖的含量测定采用硫酸-苯酚法8、9，并稍作修改。2.3.1酶储备液的配制精密称取纤维素酶（1800U/mg）0.1416g，置于500ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成510U/mL酶储备液，放置冰箱备用，使用前摇匀。2.3.2对照品溶液的制备取经105干燥至恒重的无水葡萄糖14.20mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.142mg/mL的葡萄糖对照品溶液。2.3.3线性关系的考察分别精密量取葡萄糖对照品溶液 1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00ml，置于10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。分别精密量取上述溶液各1.00mL于具塞试管中，各精密加入5%的苯酚溶液2.00mL，混匀，再加浓硫酸5.00mL，摇匀，置40水浴下30min，于490nm处测定吸光度10，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，并得出回归方程。2.3.4样品的含量测定将“2.2”项下制备的金线莲多糖样品溶液准确稀释一定的倍数，吸取1.00mL溶液，按上述步骤操作，测吸光度值A，根据回归方程计算样品溶液中多糖浓度C，再根据以下公式计算金线莲多糖得率。金线莲多糖得率（%）=C V Dm 100其中，C为金线莲多糖样品溶液的浓度（mg/mL），V为定容体积（mL），D为稀释倍数，m为金线莲粉末质量（g）。2.3.5数据处理林艺华 等：纤维素酶提取南靖金线莲多糖的工艺优化552023，32（1）福建分析测试技术交流实验数据采用SPSS22.0进行统计分析，XLS进行绘图。2.4金线莲多糖纤维素酶提取优化试验采用单因素实验，筛选出金线莲多糖最佳酶提取工艺，并进行验证。2.4.1不同酶添加量的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共5份，固定相同的料液比1：20、酶解温度55，酶解时间120min，考察酶添加量分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL时对多糖提取率的影响，按照“2.1”、“2.2”项下制备金线莲多糖样品溶液，根据“2.3.4”项含量测定方法进样分析。2.4.2不同酶解时间的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共7份，固定相同的酶添加量5.0mL、料液比1：20、酶解温度55，考察 酶 解 时 间 分 别 为 60、90、120、150、180、210、240min对多糖提取率的影响，按照上述方法进行提取分离与含量分析。2.4.3不同PH缓冲液的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共6份，固定相同的酶添加量5.0mL、料液比1：20、酶解温度55、酶解时间180min，考察添加PH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、6.6、7.0的缓冲液对多糖提取率的影响，按照上述方法进行提取分离与含量分析。2.4.4不同酶解温度的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共6份，固定相同的酶添加量 5.0mL、用 PH6.6缓冲溶液补充至料液比为1：20、酶解时间180min，考察酶解温度分别为40、50、55、60、65、70时对多糖提取率的影响，按照上述方法进行分析处理。2.4.5不同料液比的影响精密称取金线莲粉末1.00g，共5份，固定酶解温度65、酶解时间180min，添加不同比例的酶溶液和PH6.6缓冲溶液，使其料液比为1：20、1：24、1：30、1：40、1：50，考察不同料液比对多糖提取率的影响，按照上述方法进行分析处理。2.5不同样品的含量测定精密称取预处理干燥后的不同批次金线莲粉末1.00g，共3份，根据实验条件优化后的提取方法制备样品溶液，按“2.3.4”项下方法在490nm处测定吸光度并计算含量，每份平行测定3次。三 批 金