鸭腺病毒3型Fiber-2...单克隆抗体的制备及初步应用_魏常青.pdf

2023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023预防兽医预防兽医鸭腺病毒鸭腺病毒3 3型型Fiber-Fiber-2 2蛋白单克隆抗体的蛋白单克隆抗体的制备及初步应用制备及初步应用魏常青，史馨瑾，吕璐，刘英楠，谢振华，陈宗艳*，陈鸿军*（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）摘要：为进一步研究鸭腺病毒3型（DAdV-3）Fiber-2蛋白，研究通过PCR扩增fiber-2基因，构建pET32a-DAdV3-fiber2原核质粒，表达并纯化蛋白，以纯化的蛋白为免疫原，免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备抗Fiber-2单克隆抗体杂交瘤细胞，采用间接免疫荧光试验和免疫印迹试验进行鉴定，并用于DAdV-3 Fiber-2杆状病毒表达产物的鉴定。结果显示：原核表达获得1.77 mg/mL Fiber-2蛋白，筛选获得2株阳性单克隆细胞株2E10E4和4F7F10，两株单克隆抗体均为IgG 1型，轻链类型为；DAdV-3感染的LMH细胞中存在特异性荧光，免疫印迹试验确认在约59 ku处出现特异性条带；采用制备的单克隆抗体确认了表达Fiber-2蛋白的重组杆状病毒。研究获得了针对DAdV-3 Fiber-2蛋白的单克隆抗体，为深入探究Fiber-2在DAdV-3感染机制中的作用以及为建立DAdV-3抗原免疫测定技术奠定了基础。关键词：DAdV-3；Fiber-2；单克隆抗体中图分类号：S855.3文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）02-46-06收稿日期：2022-04-26；修回日期：2022-08-17基金项目：上海市自然科学基金项目（19ZR146880）作者简介：魏常青（1995-），女，博士研究生，研究方向为动物病毒学，E-mail：*通讯作者：陈宗艳（1981-），女，博士，研究员，主要从事动物病原学研究，E-mail：；陈鸿军（1979-），男，博士，研究员，主要从事非洲猪瘟感染生物学与免疫防控技术研究，E-mail：doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.008Preparation and Preliminary Application of Monoclonal AntibodyAgainst Fiber-2 Protein of Duck Adenovirus Type 3WEI Changqing,SHI Xinjin,L Lu,LIU Yingnan,XIE Zhenhua,CHEN Zongyan*,CHEN Hongjun*（Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai 200241）Abstract：To futher study Fiber-2 protein,fiber-2 gene was amplified by PCR,and pET32a-DAdV3-fiber2 prokaryoticplasmid was constructed,the protein was expressed and purified and used to immunize 6-week-age female BALB/c mice to prepare the anti-Fiber-2 monoclonal antibody hybridoma cells and identified by indirect immunofluorescence assay and Westernblot,and the recombinant baculovirus expression product.The results showed that 1.77 mg/mL of Fiber-2 protein was obtainedby prokaryotic expression and 2 positive cell lines named 2E10E4 and 4F7F10 were screened.All the strains heavy chain typewas IgG 1 and light chain type was.The specific fluorescence was found in DAdV-3-infected LMH cells by IFA and Westernblot identification revealed that a specific band appeared at about 59 ku.The recombinant baculovirus expression product ofDAdV-3 Fiber-2 was identified by the monoclonal antibody.The results suggested that the prepared monoclonal antibodiesagainst DAdV-3 Fiber-2 protein laid the foundation for an in-depth understanding of the role of Fiber-2 in DAdV-3 infectionmechanism and the establishment of DAdV-3 antigen immunoassay technology.Key words：DAdV-3;Fiber-2;monoclonal antibody-462023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023预防兽医预防兽医鸭 腺 病 毒 3 型（Duck adenovirus type 3，DAdV-3）属于禽腺病毒属腺病毒科1，其中对鸭有致病性的腺病毒包括I群禽腺病毒（血清4型、血清8型、血清11型）、鸭腺病毒1型、鸭腺病毒2型、鸭腺病毒3型。群禽腺病毒主要引起鸭“安卡拉病”；鸭腺病毒 1 型（Duck adenovirus type 1，DAdV-1）也称为减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV）或者DAdV-A，于1976年在荷兰首次被报道，水禽是其天然宿主2，鸭感染EDSV后表现出明显的呼吸道症状，并伴有轻微精神沉郁，EDSV还可以感染鸡和鹌鹑引起病禽产蛋下降3；鸭腺病毒2型（Duck adenovirus type2，DAdV-2）也称为DAdV-B，1977年首次在法国发病的番鸭中被报道，临床表现为消瘦和跛行，Bouquet等4于1982年分离得到该病毒，通过比较禽腺病毒抗原，证实该病毒不同于已知的FAdV12个血清型、TAdV血清型和DAdV-1，属于一种新型的禽腺病毒。2014年，Marek等1公布了完整的DAdV-2（GR株）基因组序列，为鸭腺病毒的科学分类奠定了基础。近年来，谢青梅等5在我国广东的番鸭中分离到一株新型的鸭腺病毒，被称为鸭腺病毒3型（DAdV-3），其致病力强，剖检病变常见肝脏出血、质地变脆、肿胀、呈浅黄色和坏死。DAdV-3有两个Fiber基因，分别编码Fiber-1和Fiber-2蛋白6。有研究表明Fiber蛋白在腺病毒感染能力和致病性中起重要作用，不仅能够诱导中和抗体的产生，而且与细胞受体相结合，并在病毒感染的早期发挥关键性作用7。本研究通过原核表达系统成功表达了Fiber-2蛋白，制备了针对该蛋白的单克隆抗体，用于鉴定DAdV-3 Fiber-2杆状病毒表达产物，为建立DAdV-3抗原免疫测定技术奠定了基础，同时为深入研究DAdV-3致病机制提供了生物材料。1材料与方法1.1病毒与菌株DAdV-3 TZ193 毒株8（GenBank 登录号：MT934842）由本实验室分离、保存；LMH细胞、草地贪夜蛾卵巢细胞系（Sf9）由本实验室保存；DH10Bac、DH5、BL21（DE3）等大肠杆菌感受态细胞购自上海擎科生物科技有限公司；BALB/c小鼠购自上海实验动物中心。1.2主要试剂病毒DNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PhantaMax Super-FidelityDNA聚合酶购自南京诺唯赞生物公司；BamH、Xho限制性内切酶购自New England Biolabs公司；pET-32a载体由本实验室保存；HRP标记的羊抗鼠IgG购自Pierce公司；FITC标记羊抗鼠IgG购自Invitrogen公司；小鼠单克隆抗体Ig类、亚类、亚型鉴定试剂盒购自齐一生物有限公司；Sf-900TM SFM、Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统、CellfectinTM Reagent 昆虫细胞转染试剂购自 ThermoFisher公司。1.3DAdV-3 fiber-2基因扩增根据DAdV-3 TZ193株基因序列（GenBank登录号：MT934842）设计fiber-2基因的特异性引物，引物序列如下：Fiber 2-F：5-CGCGGATCCATGAAACGGACCAACAGATCAGAC-3；Fiber 2-R：5-CCGCTCGAGCTAATTAACATTTGATGGGTTGCTAACG-3，目的片段大小为1 443 bp，引物由上海擎科生物科技有限公司合成（下划线分别为BamH、Xho酶切位点）。PCR扩增反应总体系为50 L，其中2Phanta Max Buffer 25L，上、下游引物各2 L，DAdV-3基因组2 L，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 L，dNTP 1 L，加ddH2O 至 50 L。扩增条件为：95 变性 5 min，95 变性30 s，55 延伸30 s，72 退火1.5 min，32个循环，72 延伸10 min，经1%琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段。1.4重组质粒构建将回收的目的片段和原核载体pET-32a进行BamH、Xho双酶切，电泳后切胶回收，加入T4连接酶进行连接，将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5中扩大培养，重组菌液使用DAdV-3fiber-2特异性引物进行鉴定，抽提质粒，送至北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pET32-D3F2。1.5原核表达与蛋白纯化将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中，在37 扩大培养重组菌液，加入浓度为1 mmol/L IPTG诱导7 h，离心破碎后，电泳观察重组蛋白表达情况，选择表达量高的菌体扩大培养并诱导，离心获得菌体沉淀送至上海吉尔生物科-472023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023技公司进行纯化。1.6小鼠免疫将纯化的菌体蛋白与完全弗氏佐剂1 1混合，经腹腔注射免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，7 d后与同等体积的不完全弗氏佐剂混合对小鼠进行二免，7 d后不加佐剂进行三免，间隔7 d进行四免，采集小鼠血液，分离血清，采用间接ELISA检测效价。1.7细胞融合及筛选选取效价较高的免疫小鼠脾细胞，与稳定培养的SP2/0细胞混合，离心弃去上清，轻轻吹打沉淀，缓慢加入 PEG，离心后用含有 20%HAT 的DMEM重悬，加入饲养细胞，铺至96孔板，37 培养47 d，观察细胞状态并适当补液。吸取融合细胞上清，经过IFA筛选阳性细胞株，扩大培养，通过有限稀释法进行两次亚克隆后基本可以确定其为稳定分泌单克隆抗体的细胞株，扩大培养并保存。1.8腹水制备取10只6周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡，10 d后腹腔注射保存的阳性杂交瘤细胞。每天观察小鼠，待其出现背毛粗乱、腹部鼓胀时，用20 mL注射器针头将腹水引流至干净的离心管中，离心收集微黄色透明腹水，每两天采集一次腹水，直至小鼠死亡。1.9单克隆抗体鉴定1.9.1间接ELISA效价测定以碳酸钠和碳酸氢钠溶液配