亚铁离子荧光探针研究进展_李佳佳.pdf

，.，.基金项目：国家自然科学基金（；）（，）：.亚铁离子荧光探针研究进展李佳佳，张瑞龙，张忠平 安徽大学化学化工学院，合肥 安徽大学物质科学与信息技术研究院，合肥 铁作为生物体内最丰富的过渡金属元素，与生命体的新陈代谢息息相关，而且铁元素主要以亚铁离子（）的形式存在于细胞内。体内 含量的失调与贫血症、癌症和心血管疾病等多种病症的发生和发展有着直接的联系。因此，监测生命体内 的浓度是评估人体健康状况的重要手段。在诸多 的检测方法中，荧光检测法因操作快速、简便并可用于体内 体外实时监测等最具发展前景。然而，在荧光检测法中探针的设计与筛选至关重要。传统的荧光探针面临的最大问题是特异性，即对 的响应常常会受到其他金属离子（如钙离子、镁离子和钾离子等）的干扰。因此，为了适用于监测生物系统中 浓度，设计出特异性强、光稳定性好、灵敏度高、检测限低和生物相容性优良的荧光探针具有重要的意义。现阶段，荧光探针主要分为两大类：有机小分子和纳米材料，其机理主要可分为三种：（）还原 类化合物；（）与 螯合；（）利用 与荧光探针发生特异性反应（如 反应、选择性断裂酰胺或羟胺键等）。本文主要归纳总结了近十几年 荧光探针的研究进展，包括制备方法、作用机理和在生命系统中检测 的应用进展。最后，对如何进一步优化 荧光探针的发光性质、检测限和特异性提出了展望。关键词 亚铁离子 荧光探针 识别 生物成像中图分类号：文献标识码：，（），（，），：（）；（）；（）（：，），引言铁元素作为人体内最丰富的过渡金属元素之一，密切参与细胞内各种生物化学反应，以不同存在形式在人体细胞内维持着一定的动态平衡，起着必不可少的作用。几乎人体内所有的细胞中都有铁的存在，其中有超过 的铁以亚铁离子形式存在于红细胞血红蛋白反应中心，参与人体内氧气的运输；剩余大部分以铁蛋白或一些酶的形式存在，作为反应活性中心，参与并调控着细胞内重要的氧化、水解和转化等过程；还有不到 的铁以游离形式存在于细胞中，参与维持细胞内其他生命活动的稳态。铁具有在氧化还原过程中多种氧化态之间循环的能力，因此对维持人体内细胞正常工作起着至关重要的作用。如果细胞中的铁没有适当的调节，其氧化还原能力可能会导致相关氧化应激反应，从而引发人的癌症、肝炎、间皮瘤和心血管等疾病。因此监测生物系统中 的动态水平对研究与铁相关的生物学过程和疾病，以及剖析 的生理和病理生理功能至关重要。但是由于 的荧光猝灭能力很强，用于监视和检测与细胞内配体弱结合的游离铁（不稳定的铁池）的保留时间和空间信息的响应方法仍然受到限制。本文将近十几年所报道的亚铁离子荧光探针分为两大类，即有机小分子和纳米材料，说明了各个荧光探针的特点，综述了探针在检测生命系统中 方面的应用进展，还讨论了这些探针的设计策略和传感机制。有机小分子 利用 被还原，荧光打开基于 氧化物的荧光探针，由于 单元的存在往往会影响探针的电子传输能力或破坏探针的共轭体系，从而导致探针的荧光减弱甚至猝灭。然而，在 检测中，正是利用 可以选择性还原 的原理，通过 与探针上的单元结合并将其选择性还原为胺基，消除了荧光猝灭的效应，设计了一系列具有荧光打开性质的 探针。年，等将间氯过氧苯甲酸罗丹明改良成探针 （见图），使罗丹明 因扭曲的内部电荷转移（，）过程和光诱导电子转移（，）效应而淬灭。当该探针与 反应时，将探针 还原成罗丹明 而重新发出荧光。探针 与细胞共孵育 ，可定位于细胞中高尔基体，不仅可以检测外源性 ，还可以检测人肝癌细胞（）和人乳腺癌细胞（）中的内源性。图 探针 的结构式（红色部分为探针与 反应位点）（电子版为彩图）（）年，等在其课题组之前研究的基础上又开发出一类探针，四个螺环化的氮氧化物作为 探针，分别为探针、和 （见表）。与第一代基于氧化物的 探针相比，通过抑制探针本身信号，螺环化策略显著提高了荧光打开效率，并且使 氧化物基团的取代基变小，从而提高了探针分子与 的反应速率。年，等受到探针 检测 的原理启发，通过将探针 中的罗丹明 分别更换成香豆素衍生物（）、罗丹明衍生物（）、罗丹明 （），成功开发出具有多种颜色发射的 选择性荧光探针系列，分别为探针、。在缺氧条件下，这类探针能够捕获 细胞氧化还原平衡对不稳定的 产生的轻微影响。其中，探针 和探针 可定位于 细胞的内质网，而探针 则存在于整个 细胞中。年，等将罗丹明衍生物与季四哌嗪结合，并通过接有长链烷烃来定位膜结构，合成出探针。在有 的溶液中，通过将探针发光主体中的 还原，用 的光激发，探针可以在 处发射荧光，而在无 的溶液中无荧光发射。进一步以 细胞为模型，用探针 进行细胞成像，结果表明，不稳定的 主要是在铁吸收途径过程（细胞吞噬和直接转运）中短暂生成的。此外，该探针还能够监测内吞摄取过程中，原代培养神经元的内源性 。随后，等利用相同的检测 的原理，在罗丹明衍生物与季四哌嗪结合的基础上再接上三苯基膦基团，合成了探针。在有 的溶液中，用 的光激发，探针可以在 处发射荧光。而三苯基膦基团可靶向线粒体，于是此探针可用于特异性检测活细胞线粒体中不稳定的 ，此外，以人胚胎肾细胞（）为模型，该探针还可以检测到细胞中多余的不稳定 的积累。表 基于探针 设计的探针 年，等利用 可以选择性将 还原成胺基的原理，设计并合成了氨基香豆素衍生物（探针），该探针发射波长为（），可用于检测 。将探针 置于 溶液中，溶液由无荧光到橙色荧光发射，与其他研究不同的是 等不仅将探针 应用于细胞成像，还将该探针应用于化妆品中 的定量检测，检测限低至 。同年，等开发出基于 选择性亚铁离子荧光探针研究进展 李佳佳等 还原氮氧化物胺基的近红外探针，与其他探针不同的是，探针 具有非常大的斯托克位移（），光激发下，处发射出近红外荧光。探针 对 的选择性高，且可以在 内快速反应，将探针 应用于癌细胞（细胞和 细胞）和正常细胞（细胞和 细胞）脂滴中的 检测。年，等基于 选择性将 还原成胺基的反应，设计并合成出一种近红外探针，该探针对 具有出色的选择性和灵敏度，检测限低至 ，而且可以与 在 内快速响应，可作为监测 的“裸眼比色传感器”。在单光子模式下，可在 处激发，在 处发射荧光，而在双光子模式下只需要 就可激发探针。在近红外附近探针 的双光子成像有利于在生物样品中对 进行深层成像。早在 年，等设计并合成出探针，利用 选择性还原 为，使得探针荧光打开。将该探针放入含 的溶液中反应 ，即可通过检测荧光强度对 浓度进行定量，线性检测范围为 。但该探针必须在酸性条件下使用，因此尚未应用于生物成像。年，等开发出一种 荧光探针。该探针基于 可选择性地将氮氧化物还原为羟胺，致使荧光打开。该探针对 的选择性高且检测限低至 ，可以在 内检测到 。探针 不仅可以用于检测水溶液中的 ，还可以检测生物系统中的 。在活细胞中的探针 可追踪细胞内 ，且该探针是首次用于监测斑马鱼中的 的荧光探针（见图）。与 螯合配位该类探针是利用 较强的螯合 配位作用，通过 与探针分子的、等原子进行配位，使得探针的状态或构效发生一定的变化，进而影响发光性质以达到检测 的目的。年，等设计并合成了一种新型的比例荧光探针（见图），该探针对 具有良好的选择性和高灵敏度，并且检测限低至 。当 与受体 结合时，从 复合物到 基团发生了有效的光诱导电子转移（）过程。可以立即猝灭 基团在 处的荧光，而 基团在 的荧光强度基本不变。荧光强度的比率（）与 的浓度呈线性关系。通过其在 和 的荧光强度比率来反映 浓度的波动。因探针 具有良好的细胞膜穿透能力和低毒性，可应用于细胞成像。共聚焦荧光比成像实验证明了该探针用于人肝细胞（）内 成像的可行性。这是第一例用于检测 的荧光比率度量探针，并可成功检测出活细胞中细胞内和吸附性 浓度的波动情况。年，等设计并合成了一种与 螯合淬灭的荧光探针。在无细胞系统中，探针 的荧光被 强烈淬灭。将该探针应用于大鼠肝细胞中，其选择性积聚在线粒体中。当铁以膜渗透性形式加入细胞时，体内线粒体中探针 的荧光被淬灭。该探针能够选择性确定完整细胞中螯合铁的高度生理和病理生理学意义的线粒体库，并记录该库变化的时间过程。随后，等在探针的基础上图 斑马鱼中 的荧光成像：（）对照斑马鱼；（）用探针（）孵育的斑马鱼；（）用 （）预处理，然后用探针 （）处理的斑马鱼；（）用 （）和 （）共同处理，然后用探针 （）处理的斑马鱼；（）（）的明场图像；（）（）的合并图像；（）图像（）的相对荧光强度 ：（）；（）（）；（）（）（）；（）（）（），（）；（）（）；（）（）；（）（）又开发了另外两种线粒体铁结合亲和力不同的探针，并将其应用于分离大鼠肝细胞线粒体中游离铁库的研究。新型罗丹明 改良的探针 仍测定出与探针 基本相同的 浓度，结合亲和力的强弱也基本相同。这证明了该实验的可靠性，即这些探针对 的络合作用不会从铁存储蛋白中诱导显著的 释放。相反，由罗丹明 改良的另一种探针 不能与内源性配体竞争，比可螯合亚铁离子的内源性化合物的总浓度低大约三个数量级。据估计，可螯合的线粒体 被内源性配体结合，表观稳定常数在 之间。材料导报，（）：年，等将丹磺酰与苯乙烯基喹啉结合，设计出一种新型“”探针。该探针对 的选择性优于其他过渡金属离子，包括 。在背景中常见干扰金属离子的存在下，添加 可以增强该探针在 处的荧光发射，荧光强度可提高 倍。且探针 检测极限低，可以对亚毫摩尔浓度的 进行荧光检测，但其水溶性和荧光强度有待进一步提高。年，等设计并合成出一种基于香豆素的“”型荧光探针。该探针对 具有高度选择性，并且可以在水性介质中可逆地检测到它们。基于探针 的良好水溶性，将其应用于人神经母细胞瘤细胞（）中，其定位在细胞膜上，可以检测到细胞膜上 浓度的变化。分子动力学模拟表明该探针可与脂质双层相互作用。年，等成功合成了一种基于萘醌的 的探针。探针 与 螯合后，分子内电荷转移效应（）明显增强，从而“打开”探针的荧光响应，该反应机理已通过傅里叶变换红外分析，滴定和量子化学计算证实。探针 对 的检出限低至 ，其最显著特征的是它能够通过肉眼直接观察，而且已成功应用于人类癌细胞和斑马鱼中的 生物标记物。年，等设计并合成了一种萘吡啶席夫碱探针，该探针通过与 配位，利用 效应，在 处发射荧光，可检测 溶液中的 。该探针对水性介质中 具有高选择性和灵敏度，其检测下限为 。该探针可检测市售片剂、番茄汁、黑巧克力和自来水中的 浓度。目前该探针还未应用于其他领域，但可以作为生物和环境监测工作中检测 的潜在探针。年，等以高产量合成了一种基于罗丹明的 荧光“打开”探针。该探针以 的比例对 进行高选择性配合反应，且在 的浓度范围内对 表现出线性响应，且探针几乎不受其他过渡金属离子的干扰。由于螺环的开环相互作用，在 存在下观察到它们的荧光增强。通过共聚焦激光扫描显微镜实验，已证明该探针可用于监测活 巨噬细胞中的 。年，等通过将苯并噻唑基团引入到罗丹明酚羟基的邻位上，设计并合成了一种发光探针。该探针具有长达 的斯托克斯位移，并具有聚集诱导发射（）和激发态分子内质子转移（）功能的协同效应。此外，探针 对 表现出敏感的荧光响应，检测限低至 ，且选择性高。其检测机理的研究表明，与探针分子的配位作用破环了探针分子原有的 过程，诱导淬灭蓝绿色荧光（）。该工作中 荧光团的开发将为生物传感器提供可行的设计策略。以上，笔者总结了基于有机小分子与 螯合配位的特性而设计的荧光探针，其具体结构式如图 所示。图 探针 的结构式（红色部分为探针与 反应位点）（电子版为彩图）（）基于其他化学反应的 传感策略除了上述提到的两种构建 荧光探针的设计思路，还可以利用 与其他化学基团（例如酰胺键、和芬顿反应等）进行化学反应，从而影响探针的荧光发射性质，来设计探针的分子结构，以实现对 的特异性检测。年，等通过将酰化羟胺部分结合到萘二甲酰亚胺荧光团中，开发了一种新的“”选择性荧光探针。可以选择性断裂羟胺键，探针荧光打开。该探针可在 内对 做出响应，且对 的选择性好，与 反应后荧光强度增强了 倍以上，灵敏度低至 。由于该探针以上优良性能