亚低温对脓毒症小鼠肺损伤及...rf2_HO-1通路的影响_林冬梅.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）亚低温对脓毒症小鼠肺损伤及Nrf2/HO-1通路的影响*林冬梅1，蒋良艳2，赖洁2，黄晓2，胡军涛2，汤展宏2（广西医科大学第一附属医院1.急诊科；2.重症医学科，南宁530021）摘 要目的：探究亚低温对脓毒症小鼠肺损伤及核因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶1（HO-1）通路的影响。方法：野生型（WT）和Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）C57/BL6小鼠各20只，分别随机分为假手术常温组（S组）、假手术亚低温组（SH组）、脓毒症常温组（N组）和脓毒症亚低温组（H组），每组5只。采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型。采用苏木精伊红（HE）染色观察肺组织损伤情况，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-（TNF-）和白介素-1（IL-1）水平，试剂盒检测肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。分别采用western blotting和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测肺组织中Nrf2和 HO-1基因及蛋白表达。结果：与S组相比，WT和Nrf2-KO小鼠N组TNF-、IL-1和MDA含量升高，HO-1 mRNA及蛋白表达量升高，SOD活性降低（均P0.05），肺组织损伤严重。WT小鼠N组Nrf2 mRNA及蛋白表达量较S组升高（P0.05），而Nrf2-KO小鼠各组Nrf2均无表达。与N组相比，WT小鼠H组TNF-、IL-1和MDA含量降低，SOD活性升高，Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达量升高（均P0.05），肺组织损伤减轻；而Nrf2-KO小鼠H组与N组上述各指标比较，差异均无统计学意义（P0.05）。结论：亚低温可以减轻脓毒症小鼠肺损伤，其机制可能与激活肺组织Nrf2/HO-1通路，增强抗氧化应激能力，以及减少炎症因子的生成有关。关键词亚低温；脓毒症；肺损伤；Nrf2/HO-1通路；Nrf2基因敲除中图分类号：R459.7文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-1918-06DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.008Effects of mild hypothermia on lung injury and Nrf2/HO-1 pathway in septic miceLin Dongmei1,Jiang Liangyan2,Lai Jie2,Huang Xiao2,Hu Juntao2,Tang Zhanhong2.(1.Emergency Department;2.Department of Critical Care Medicine,The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning530021,China)Abstract Objective:To investigate the effects of mild hypothermia on lung injury and nuclear factor E2-relatedfactor 2/heme oxygenase 1(Nrf2/HO-1)pathway in septic mice.Methods:Twenty wild-type(WT)and Nrf2gene knockout(Nrf2-KO)C57/BL6 mice were randomly divided into sham-operated normothermia group(Sgroup),sham-operated mild hypothermia group(SH group),sepsis normothermia group(N group)and sepsismild hypothermia group(H group),with 5 mice in each group.The sepsis model was prepared by cecal ligationand puncture.Hematoxylin-eosin staining(HE staining)was used to observe lung injury;enzyme linked immuno-sorbent assay(ELISA)was used to measure the levels of tumor necrosis factor (TNF-)and interleukin 1(IL-1)in alveolar lavage fluid of each group of mice;kits were used to measure superoxide dismutase(SOD)activi-ty and malondialdehyde(MDA)content in lung tissues;protein immunoblotting(western blotting)and real-timefluorescence quantitative PCR(RT-qPCR)techniques were used to measure the expressions of Nrf2 and HO-1proteins and their genes in lung tissues respectively.Results:Compared with group S,the contents of TNF-,IL-1 and MDA as well as the mRNA and protein expressions of HO-1 in N group of WT and Nrf2-KO mice in-creased,while SOD activity decreased(P0.05),and lung tissue damage was serious.The mRNAand protein ex-pressions of Nrf2 in group N of WT mice were higher than those in group S(P0.05),but no Nrf2 expressionwas found in all groups of Nrf2-KO mice.Compared with group N,the TNF-,IL-1 and MDA contents de-creased,the SOD activity as well as the mRNA and protein expressions of Nrf2,HO-1 increased(all P0.05)and lung tissue damage was reduced in the group H ofWT mice;however,there was no statistically signifi-cant difference between group H and N for the above*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81960342）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-11-01 1918indexes in the Nrf2-KO mice(P0.05).Conclusions:Mild hypothermia can alleviate lung injury in septic mice,and its mechanism may be related to activating Nrf2/HO-1 pathway in lung tissues,increasing its antioxidantstress capacity and reducing the production of inflammatory factors.Keywordsmild hypothermia;sepsis;lung injury;Nrf2/HO-1 pathway;nuclear factor E2-related factor 2 geneknockout脓毒症为宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍1。在众多受损的器官中，肺是最常见也是最早受累的器官2。亚低温（3235）已被证实具有抑制炎症反应、改善氧化应激以及调节机体代谢等作用，可减轻心、肝、肺、肾、脑等多器官损害3，亚低温已成为某些特定的缺血缺氧性疾病的常规治疗方法，但在脓毒症方面的研究较少。有研究表明，亚低温可改善脓毒症早期预后，但其作用机制尚未明确4。核因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞抗炎和抗氧化反应的重要转录因子，是脓毒症治疗的一个新靶点5。Eskla 等6研究表明，亚低温能够激活 Nrf2，从而减轻氧化应激损伤。本实验用野生型（WT）和Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）小鼠，探讨亚低温对脓毒症小鼠肺损伤的治疗作用是否与激活Nrf2/血红素加氧酶1（HO-1）通路而减轻氧化应激损伤有关。1材料与方法1.1实验动物89周龄SPF级C57BL/6 WT小鼠20只，Nrf2-KO小鼠20只，体重2026 g，购自武汉有度生物科技有限公司，许可证号为SCXK（鄂）2021-0025。本实验经广西医科大学动物伦理委员会批准（审批号：202109005），实验期间对动物的处理符合 中国实验动物系统伦理审查委员会指南 的规定。1.2实验试剂戊巴比妥钠购自美国 Sigma 公司；丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Nrf2抗体（ab137550）购自Abcam；-actin抗体（CST4970）、HO-1抗体（CST43966）和山羊抗兔IgG（H+L）（Dy-Light 800）二抗购自美国Cell Signaling Technology公司；BCA法蛋白定量试剂盒（增强型）购自上海碧云天生物技术有限公司；肿瘤坏死因子（TNF-）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；白介素1（IL-1）ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。1.3实验方法1.3.1脓毒症小鼠模型的建立与分组20 只C57BL/6野生型小鼠和20只Nrf2-KO小鼠各随机分为4组：假手术常温组（S组）、假手术亚低温组（SH组）、脓毒症常温组（N组）和脓毒症亚低温组（H组），每组5只。术前禁食12 h，自由饮水。脓毒症模型的建立采用盲肠结扎穿孔（CLP）法7。术前称量并记录小鼠体重，以0.5%的戊巴比妥钠（100mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，腹部备皮，碘伏消毒腹部皮肤，于腹中线做一1.5 cm左右的开口，打开腹腔拉出盲肠，用镊子将盲肠内容物轻轻挤向盲肠末端，于盲肠末端至回盲瓣1/2处结扎盲肠，用20 G针头对穿结扎段盲肠，并挤出针尖样大小的肠内容物，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合。假手术组仅开腹腔翻盲肠、还纳盲肠、逐层关腹而不作盲肠结扎穿刺。术后取1 mL已预热37 的生理盐水皮下注射抗休克，常温组小鼠肛温控制在36 38；亚低温组肛温控制在 3235，8 h 后缓慢复温（0.5/h），12 h后处死，收集肺泡灌洗液及肺组织，检测相关指标的变化。1.3.2肺组织苏木精伊红（HE）染色建模12 h后处死小鼠，取其左下肺叶放入4%多聚甲醛内固定，24 h后行石蜡包埋、切片、HE染色等处理，后在全玻片扫描系统VS200中观察肺组织病理改变。1.3.3ELISA法检测肺泡灌洗液中 IL-1和TNF-水平建模12 h后处死小鼠，收集肺泡灌洗液，4 下3 000 r/min离心10 min后取上清，置于-80 冰箱中保存以备用，用 ELISA 法检测肺泡灌洗液中IL-1及TNF-的水平，具体操作按相应试剂盒进行。1.3.4肺