新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备_彭晓燕.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 1 期 102 106Current Biotechnology ISSN 2095-2341研究论文研究论文Articles新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备彭晓燕，陆盼盼，胡祖权*贵州医科大学生物与工程学院，贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心，贵阳 550025摘 要：为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2（简称新型冠状病毒，severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2，SARS-CoV-2）S蛋白受体结合域（receptor binding domain,RBD）并制备多克隆抗体，利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)上，电转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，利用优化后的表达条件大量表达重组蛋白，经亲和层析纯化后通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。利用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原免疫小鼠制备多克隆抗体，ELISA和Western blot分析抗血清的效价和特异性。PCR鉴定和序列测定结果显示，成功构建了重组载体pGEX-RBD和pET-RBD，在大肠杆菌中实现了GST-RBD和RBD-His融合蛋白的可溶性高效表达。研究获得的多克隆抗体的滴度达到约1 3 000，并具有良好的结合特异性。原核表达的可溶性新型冠状病毒RBD重组蛋白具有良好的免疫原性，为后续制备基因工程抗体奠定了实验基础。关键词：新型冠状病毒；受体结合域；原核表达；融合蛋白；多克隆抗体DOI：10.19586/j.20952341.2022.0114 中图分类号：R392.11，Q786 文献标志码：AProkaryotic Expression of the RBD Protein of SARS-CoV-2 and its Polyclonal Antibodies PreparationPENG Xiaoyan，LU Panpan，HU Zuquan*Immune Cells and Antibody Engineering Research Center of Guizhou Province，School of Biology and Engineering，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，ChinaAbstract：To obtain the receptor binding domain（RBD）of S protein of severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2（SARS-CoV-2）in prokaryotic cells and further prepare its polyclonal antibodies，the RBD gene was connected into prokaryotic expression vectors of pGEX-6p-1 and pET-32a（+）by gene cloning technology.The recombinant plasmids were then transformed into the competent cells of Escherichia coli strain XL1-blue.The recombinant proteins were largely expressed by the optimized expression conditions.After purification by affinity chromatography，the expression of recombinant proteins was detected by SDS-PAGE.Polyclonal antibodies were prepared by immunizing mice with GST-RBD fusion protein as immune antigen.Their titers and specificity were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）and Western blot.The PCR identification and sequencing results showed that the recombinant vectors of pGEX-RBD and pET-RBD were successfully constructed.The fusion proteins of GST-RBD and RBD-His were achieved efficient and soluble expression in E.coli.The titers of the obtained polyclonal antibodies reached approximately 1 3 000 and they had good binding specificities.The soluble recombinant RBD protein of novel coronavirus expressed in prokaryotic cells has good immunogenicity，which layed an experimental foundation for the further preparation of genetic engineering antibodies.Key words：SARS-CoV-2；receptor binding domain（RBD）；prokaryotic expression；fusion protein；polyclonal antibody严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）收稿日期：20220629；接受日期：20220928基金项目：国家自然科学基金项目（31660258）；贵州省自然科学基金项目（黔科合平台人才 2021 5637号；黔科合基础-ZK 2021 重点029）。联系方式：彭晓燕E-mail：；*通信作者 胡祖权E-mail：彭晓燕，等：新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备简称新型冠状病毒，能够引起严重的急性呼吸道疾病，具有极强的传染性。该病毒在世界范围内流行并不断出现新的变异毒株，给全球公共卫生安全带来严峻挑战和威胁，免疫学诊断和治疗是目前研究的重点领域1-2。新型冠状病毒由囊膜和核衣壳组成，囊膜上主要有表面刺突蛋白（spike protein，S）、膜蛋白（membrane protein，M）和包膜蛋白（envelope protein，E）等3种结构蛋白质3，其中S蛋白与其传染能力及致病机制密切相关。在病毒进入宿主细胞的过程中，S蛋白会被宿主细胞的蛋白酶切割为 S1亚基和 S2亚基，分别负责受体识别和膜融合4。S1 亚基又分为 N 末端结构域（N terminal domain，NTD）和 C 末 端 结 构 域（C-terminal domain，CTD），蛋白晶体结构显示新型冠状病毒的CTD 为 受 体 结 合 域（receptor binding domain，RBD），主要负责识别细胞表面特异性受体血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE2），从而介导病毒与宿主细胞的相互作用4-6。因此，阻断RBD与ACE2的结合能够阻止新型冠状病毒进入细胞内，以RBD为靶标的特异性抗体或小分子抑制剂是抗新型冠状病毒药物研发的有效策略之一3，7。同时，免疫学诊断具有操作简单、特异性高、重复性好和高效低廉等优点，现已成为临床上最普遍的检测手段之一8-10，优化基于抗RBD抗体的免疫诊断方法对于新型冠状病毒的快速初筛和日常监测具有重要意义。本研究通过基因克隆操作构建原核表达系统，在大肠杆菌中大量表达含有不同标签蛋白的RBD重组蛋白，并验证其可溶性和免疫原性，以期为通过抗体库技术分离抗RBD重组抗体及进一步发展新型冠状病毒的免疫诊疗方法奠定基础。1材料与方法1.1实验材料大肠杆菌 XL1-Blue、pGEX-6P-1 和 pET-32a（+）载体由华中农业大学分子生物技术实验室馈赠，含 RBD 基因的 pET-32-RBD 质粒由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所苏州研究院馈赠。68周龄Balb/c小鼠由贵州医科大学实验动物中心（许可证号：SCXK（黔）2018-0001）提供，室温 2025，光照黑暗周期为 12 h，分笼标准饲养，自由采食饲料和水。1.2仪器与试剂酶标仪购自 BioTech 公司；冷冻高速离心机购自丹麦LaboGene公司；超声波破碎仪购自宁波新芝生物科技有限公司；恒温摇床购自苏州捷美电子有限公司；垂直电泳仪和凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司；转印仪、水平和垂直电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；PCR仪购自美国ABI公司；纯水仪购自英国ELGA公司；Syngene 成像系统购自基因有限公司；Tryptone 和Yeast extract 购自英国 OXOID 公司；脱脂奶粉购自武汉博士德生物工程有限公司；对硝基苯磷酸二钠购自上海Sigma-Aldrich公司；质粒DNA提取试剂盒购自Omega公司；亲和层析柱和Ni-NTA基质购自德国Qiagen公司；GST纯化基质购自上海碧云天生物技术有限公司；工具酶购自宝日医生物技术（北京）有限公司；AP标记和HRP标记羊抗鼠抗体购自上海默克公司；ECL发光液购自大连博格林生物科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.3原核表达载体构建培养含 pET-32-RBD 质粒的重组大肠杆菌，用质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA，通过PCR扩增目的基因，采用EcoR 和Not 双酶切RBD片段、pDEX-6P-1 载体和 pET-32a（+）载体，制备1%琼脂糖凝胶电泳检测。随后，利用T4 DNA连接酶连接目的基因和载体，构建重组载体pGEX-RBD和pET-RBD。电转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，涂布于LB固体培养基（含100 g mL-1氨苄）平板，37 过夜培养1216 h至长出单克隆菌落。挑取菌落培养，利用基因特异引物进行 PCR 鉴定，并送公司用载体特异引物测序验证。1.4RBD蛋白的原核表达及纯化取测序正确的 pGEX-RBD 和 pET-RBD 重组质粒菌液分别接种于含100 g mL-1氨苄的LB液体培养基中，37，200 r min-1振荡培养1216 h。将培养菌液按1 100接种于新鲜培养基中，37、200 r min-1振荡培养至OD600达到0.40.6时，加入终浓度为1 mmol L-1的IPTG，置16、200 r min-1恒温摇床诱导培养20 h，离心收集菌体。PBS悬浮菌体，超声波破碎处理后收集上清液，利用GST纯化柱纯化 GST-RBD 融合蛋白，以及 Ni-NTA 基103生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology质纯化 RBD-His 融合蛋白，SDS-PAGE 凝胶电泳检测蛋白的表达情况。1.5多克隆抗体的制备用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原，取3只6周龄Balb/c小鼠进行免疫，共进行4次免疫，每次免疫间隔时间为 10 d，抗原剂量为每只小鼠25 g。初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第2次和第3次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第4次免疫用等量生理盐水混合。完成4次免疫后7 d取小鼠静脉血制备抗血清。1.6间接ELISA法测定抗血清滴度用PBS稀释RBD-His融合蛋