鹰嘴豆抗氧化肽的分离纯化、鉴定及其抗氧化活性_梁雪荣.pdf

生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.04 209鹰嘴豆抗氧化肽的分离纯化、鉴定及其抗氧化活性梁雪荣，路振康，毛晓英*，吴庆智，张 建（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）摘 要：以发芽鹰嘴豆为原料，制备鹰嘴豆抗氧化肽，采用葡聚糖凝胶对其进行分离纯化，通过测定自由基清除能力、还原力、脂质氧化抑制能力、对自由基诱导的蛋白质和DNA损伤的保护能力评价纯化肽的抗氧化活性。对纯化肽进行鉴定合成以验证其抗氧化活性，并对合成多肽进行安全性预测。结果表明，纯化后的多肽有较好的自由基清除能力、还原力，且对亚油酸自氧化有明显的抑制作用，对自由基诱导的蛋白质和DNA损伤有保护作用。经预测，合成多肽无毒性与致敏性。综上，发芽鹰嘴豆水解物具有抗氧化能力，可用来制备抗氧化肽，从而增加鹰嘴豆的利用价值。关键词：抗氧化肽；自由基清除活性；氧化损伤保护；鉴定；合成Purification,Identification and Antioxidant Activity of Antioxidant Peptides from Chickpea Protein HydrolysateLIANG Xuerong,LU Zhenkang,MAO Xiaoying*,WU Qingzhi,ZHANG Jian(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China)Abstract:Inthisstudy,anantioxidantpeptidewaspurifiedfromtheproteinhydrolysateofgerminatedchickpeabySephadexcolumnchromatography,anditsantioxidantactivitieswereevaluatedbydeterminingfreeradicalscavengingcapacity,reducingpower,lipidoxidationinhibitoryeffectandprotectiveeffectagainstfreeradical-induceddamagetoproteinsandDNA.Thepurifiedpeptidewasidentifiedandsynthesizedtoverifyitsantioxidantactivities,andthesafetyofthesyntheticpeptidewaspredicted.Theresultsshowedthattheantioxidantpeptidehadgoodfreeradicalscavengingabilityandreducingpower,significantlyinhibitedtheautooxidationoflinoleicacid,andprotectedagainstproteinandDNAdamageinducedbyfreeradicals.Itwaspredictedthatthesyntheticpeptidehadnotoxicityorallergenicity.Inconclusion,theproteinhydrolysateofgerminatedchickpeahasantioxidantcapacityandcanbeusedtoprepareantioxidantpeptides,whichwillimprovetheutilizationvalueofchickpea.Keywords:antioxidantpeptides;freeradicalscavengingactivity;protectionagainstoxidativedamage;identification;synthesisDOI:10.7506/spkx1002-6630-20211214-165中图分类号：TS214.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）04-0209-08引文格式：梁雪荣,路振康,毛晓英,等.鹰嘴豆抗氧化肽的分离纯化、鉴定及其抗氧化活性J.食品科学,2023,44(4):209-216.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211214-165.http:/LIANG Xuerong,LU Zhenkang,MAO Xiaoying,et al.Purification,identification and antioxidant activity of antioxidant peptides from chickpea protein hydrolysateJ.Food Science,2023,44(4):209-216.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211214-165.http:/收稿日期：2021-12-14第一作者简介：梁雪荣（1997）（ORCID:0000-0002-3014-5505），女，硕士，研究方向为植物蛋白及功能性食品。E-mail:*通信作者简介：毛晓英（1976）（ORCID:0000-0001-8773-2172），女，教授，博士，研究方向为植物蛋白及功能性食品。E-mail:自由基的过度产生会导致氧化应激，破坏DNA、蛋白质和脂质并中断各种生理功能，引起多种慢性疾病，甚至产生急性氧中毒导致生命危险1。此外，过多的自由基会产生氧化作用，这可能会降低食品的质量，缩短食品的保质期2。合成抗氧化剂（叔丁基对苯二酚、没食子酸丙酯和丁基羟基茴香醚等）可有效控制食物营养物210 2023,Vol.44,No.04 食品科学 生物工程质的氧化。此外，膳食中摄入的抗氧化剂也可以降低与氧化应激相关的慢性疾病风险3。然而，合成抗氧化剂具有损伤DNA和潜在毒性风险的缺点。因此，近年来，从天然来源中寻找新的、安全的抗氧化剂，用于食品 和医药材料，以取代合成抗氧化剂，引起了人们极大的兴趣4。值得注意的是，源自植物蛋白的天然抗氧化肽因其环保、可持续、无毒副作用等优点而受到广泛关注5。近年来，人们从植物蛋白如鹰嘴豆等各种生物资源中鉴定并表征了具有更多营养价值的生物活性肽。鹰 嘴 豆（C i c e r a r i e t i n u m L.）为 豆 科（Leguminosae）重要作物，是世界上仅次于大豆和豌豆的第3大重要谷物豆类，主要用作人类食物来源，它是植物蛋白最经济的来源之一6。鹰嘴豆蛋白被认为是良好的膳食蛋白质来源，是因为其氨基酸组成平衡、蛋白质生物利用度高7。鹰嘴豆蛋白水解物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌、血管紧张素转换酶抑制和降血脂等8-9。学者们通过酶解鹰嘴豆蛋白制备了多种生物活性肽，其中以具有抗氧化活性的肽研究报道 较多5,7。因此，有关鹰嘴豆抗氧化肽的研究已成为当前一个研究热点。然而，鹰嘴豆的高营养价值通常会受到一些抗营养因子的影响，如胰蛋白酶抑制剂、单宁、植酸和皂苷等10。发芽可以改善鹰嘴豆粉的功能特性和鹰嘴豆分离蛋白的抗氧化特性，并显著减少其抗营养 因子11-12。因此，在这项工作中，以发芽鹰嘴豆为原料，制备了鹰嘴豆抗氧化肽，采用葡聚糖凝胶对其进行分离纯化，通过测定各种自由基清除能力、还原力、脂质氧化抑制能力、对自由基诱导的蛋白质和DNA损伤的保护能力评价纯化肽的抗氧化活性。并且对纯化肽通过鉴定合成验证了其抗氧化活性。最后对抗氧化肽进行安全性预测，为开发具有抗氧化功能的鹰嘴豆抗氧化肽提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂鹰嘴豆（卡布里型）产自新疆木垒县；pBR322质粒DNA 上海保藏生物技术中心；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、碱性蛋白酶（酶活力2.0105 U/g）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐（2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、2,2-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2,2-azo-bis(2-methylpropionamide)-dihydrochloride，AAPH）、SephadexG-75 北京索莱宝科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、三氟乙酸（均为色谱纯）美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备DBS-100蛋白质纯化系统 上海青浦沪西分析仪器厂有限公司；高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；多功能酶标仪 美国Thermo公司；SCIENTZ-18N型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；L-8900型高速氨基酸分析仪 日本日立有限公司；LC-2010A HT型液相色谱仪 日本岛津公司；毛细管高效液相色谱仪、电喷雾-组合型离子阱Orbitrap质谱仪 美国Thermo公司。1.3 方法1.3.1 鹰嘴豆多肽的制备将挑选好的鹰嘴豆先浸泡12 h，然后在室温下每隔6 h喷水，使其发芽23 d，芽长达到23 cm左右，制备发芽鹰嘴豆。以发芽鹰嘴豆为原料，采用低温烘干，经高速粉碎机粉碎，过60 目筛，制备发芽鹰嘴豆粉，脱脂后于4 贮存备用。发芽鹰嘴豆蛋白的制备参考FengLi等13的方法并作修改。将发芽鹰嘴豆粉与水以一定的比例混合，用0.5 mol/L NaOH溶液调节pH值至9，搅拌1 h，4 000g离心10 min，所得沉淀重复提取2 次。将3 次上清液混合，用0.5 mol/L HCl溶液调节pH 4.3，8 000g离心10 min，用蒸馏水洗涤沉淀，并将所得蛋白浆pH值调节至7.0，冷冻干燥48 h即为鹰嘴豆蛋白，20 贮存备用。鹰嘴豆多肽的制备参考YangJing等14的方法并作修改。根据前期实验结果得出，采用碱性蛋白酶按照底物质量浓度2g/100 mL、酶用量8 000 U/g、pH 8.0、温度50、酶解时间60 min的条件进行酶解，酶解之后，90 水浴10 min进行灭酶，7 000g离心10 min，收集上清液并冷冻干燥，20 贮存备用。1.3.2 鹰嘴豆多肽基本成分及氨基酸的测定水分含量测定：直接干燥法（GB 5009.32016食品中水分的测定）；蛋白质含量测定：凯氏定氮法（GB 5009.52016食品中蛋白质的测定）；脂肪含量测定：索氏提取法（GB 5009.62016食品中脂肪的测定）；灰分含量测定：灰化法（GB 5009.42016食品中灰分的测定）。使用L8900高速氨基酸分析仪进行氨基酸分析。每个样品在110 用密封和真空玻璃管中的6 mol/L HCl溶液水解24 h。消化后的样品定容至25 mL容量瓶。取5 mL消化液于60 干燥，并用醋酸钠缓冲溶液（pH 6.4）稀释。氨基酸组成分析结果以mg/g表示。1.3.3 凝胶色谱法分离抗氧化肽抗氧化肽的分离参照LiuJingbo等15的方法，稍作修改。将鹰嘴豆蛋白水解物以30mg/mL的质量浓度溶解在超纯水中，然后将3 mL样品加入SephadexG-75柱（1.6 cm50 cm），用超纯水预平衡。将流速调整为生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.04 2110.5 mL/min，每3.5 min将洗脱液收集到管中，280 nm波长处测定吸光度绘制峰形图。收集出峰组分，冷冻干燥后测定抗氧化活性，并选取活性最高的组分用于后续分析。1.3.4 鹰嘴豆纯化肽分子质量分布的测定参照Yu Yihan等16的方法，略有修改。使用LC-2010A HT型液相色谱议（配有紫外检测器）；色谱条件：TSKgel2000SWXL300mm7.8 mm色谱柱；流动相：乙腈-水-三氟乙酸（45 55 0.1，V/V）；紫外检测波长220 nm；流速0.5 mL/min；柱温25；进样量10L。分子质量校正曲线所用标准品