异鼠李素对口腔鳞癌细胞增殖...移和凋亡的影响及其机制研究_冯冰华.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）异鼠李素对口腔鳞癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制研究*冯冰华，粟小平，李翠萍，韦珍夏，吕薇，黄旋平（广西医科大学口腔医学院/附属口腔医院颌面外科，广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室，广西颅颌面畸形临床医学研究中心，南宁530021）摘要目的：探讨异鼠李素对口腔鳞癌细胞（SCC-9、SAS）增殖、迁移和凋亡的影响及其机制。方法：体外培养SCC-9、SAS细胞，加入不同浓度的异鼠李素，CCK-8法检测细胞活力。将SCC-9、SAS两种细胞分别分为3组：对照组（不予处理）、低剂量组和高剂量组。用平板克隆实验检测细胞集落形成情况，划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞水平及垂直迁移情况，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blotting法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达。结果：随着异鼠李素浓度增加，SCC-9、SAS细胞增殖抑制率升高（P0.05）。与对照组相比，两种细胞的低剂量组和高剂量组克隆形成率和水平迁移率降低，垂直迁移细胞数减少，两种细胞的高剂量组细胞凋亡率升高（均P0.05）。SCC-9、SAS细胞高剂量组PI3K110、PI3K85、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、S6、p-S6蛋白表达水平均低于对照组（P0.05）。结论：异鼠李素可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移，并促进细胞凋亡。关键词异鼠李素；口腔鳞状细胞癌；增殖；迁移；凋亡中图分类号：R739.8文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-1951-07DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.013Effects and mechanism of isorhamnetin on proliferation,migration and apoptosis of oralsquamous cell carcinoma cellsFeng Binghua,Su Xiaoping,Li Cuiping,Wei Zhenxia,Lyu Wei,Huang Xuanping.(Department of Oral and Max-illofacial Surgery,College&Hospital of Stomatology，Guangxi Medical University;Guangxi Key Laboratory ofOral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction;Guangxi Clinical Research Center for Craniofacial De-formity,Nanning 530021,China)AbstractObjective:To investigate the effects and mechanism of isorhamnetin on proliferation,migration andapoptosis of oral squamous cell carcinoma(SCC-9,SAS)cells.Methods:SCC-9 and SAS cells were cultured invitro,and different concentrations of isorhamnetin were added to detect the cell viability by CCK-8 method.SCC-9 and SAS cells were divided into three groups:control group(no treatment),low-dose group and high-dosegroup.Cell colony formation was detected by plate cloning assay.The horizontal and vertical migration of cellswere detected by scratch and Transwell migration assay.Cell apoptosis was detected by flow cytometry,and pro-tein expressions related to PI3K/AKT/mTOR signaling pathway were detected by Western blotting.Results:With the increase of isorhamnetin concentration,the proliferation inhibition rate of SCC-9 and SAS cells in-creased(P0.05).Compared with the control group,the clone formation rate and horizontal migration rate de-creased in the low-dose and high-dose groups of the two kinds of cells,the number of vertical migration cells de-creased,and the apoptosis rate increased in the high-dose group of the two kinds of cells(all P0.05).The pro-tein expressions of PI3K110,PI3K85,AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR,S6 and p-S6 in SCC-9 and SAS cell high-dose groups were lower than those in the control group(P0.05).Conclusion:Isorhamnetin may inhibit the pro-liferation as well as the migration and promote theapoptosis of SCC-9 and SAS cells by inhibitingPI3K/AKT/mTOR signaling pathway.Keywordsisorhamnetin;oral squamous cell carci-noma;proliferation;migration;apoptosis*基金项目：广西科技基地和人才专项（No.2021AC18031）；广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用项目（No.S2021085）；南宁市青秀区科技计划项目（No.2021004）通信作者，E-mail:收稿日期：2022-10-27 1951广西医科大学学报2022 Dec；39（12）口腔癌是常见的口腔颌面部肿瘤，恶性程度高，约 90%的病理类型为口腔鳞状细胞癌（OS-CC）1。据统计，2020年全世界约有37.7万口腔癌新增病例，约有17.7万死亡病例2。虽然临床诊疗技术的提高和多学科协作可改善患者的预后，但患者的5年生存率仅保持在50%左右3。中草药植物因其抗肿瘤特性和副作用少的优势已成为目前的研究热点4。近40年来，约有33.5%的抗肿瘤药物来源于天然产物5。异鼠李素是一种天然的小分子黄酮类化合物，可在沙棘、银杏等植物中分离提纯。研究表明，异鼠李素在胃癌6、胰腺癌7、胆囊癌8中可抑制癌细胞增殖并诱导癌细胞凋亡。然而目前关于异鼠李素在OSCC方面的研究鲜少报道。本研究旨在探讨异鼠李素对OSCC细胞增殖、迁移和凋亡的影响，并进一步阐明其作用机制。1材料与方法1.1细胞与主要试剂人 OSCC 细胞株 SCC-9、SAS 购自科佰生物科技有限公司。异鼠李素（规格：10 mg/支，HPLC98%，CAS 号：480-19-3）和DMEM-F12培养液均购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清由以色列Biological Industries公司生产；CCK-8检测试剂盒由日本东仁化学科技公司生产；BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒由北京四正柏生物科技有限公司生产；PrimeScript RT试剂盒购自北京康润诚业生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）110、PI3K85、蛋白激酶 B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、S6核糖体蛋白、磷酸化S6（p-S6）抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。1.2细胞培养与分组SCC-9、SAS 细胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素链霉素溶液的DMEM-F12培养基培养，置于37、5%CO2细胞培养箱中，0.25%胰蛋白酶消化、传代。取对数生长期的SCC-9、SAS细胞，分别分为3组：对照组（不予处理）、低剂量组和高剂量组。1.3CCK-8法检测细胞增殖在96孔细胞培养板中分别加入100 L的SCC-9、SAS细胞悬液（5103个/孔），加入不同浓度（0 g/mL、6.25 g/mL、12.5 g/mL、25 g/mL、50 g/mL、100 g/mL）的异鼠李素，每个浓度设置5个复孔。药物干预24 h、48 h、72 h后去除原培养液，加入100 L CCK-8溶液，于37 培养箱中避光孵育3 h，用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光度（OD）值，并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（对照组OD实验孔OD）/（对照组OD空白组OD）100%。计算SCC-9、SAS细胞的半数抑制浓度（IC50）。1.4平板克隆实验检测细胞集落形成水平将SCC-9、SAS细胞分别接种在6孔板中（500个/孔），细胞分组处理后弃去培养基，加入甲醇溶液固定15 min，0.5%结晶紫溶液染色30 min。拍照、计算克隆形成率，克隆形成率（%）=克隆细胞数/接种细胞数100%。1.5划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移划痕实验：将SCC-9、SAS细胞分别接种在6孔板中（1106个/孔），待细胞融合度达到100%后，用100 L移液器枪头垂直于孔板在细胞表面划直线，按分组加入含异鼠李素的无血清培养基进行培养，分别于0 h、12 h、24 h在显微镜下观察并拍照，记录划痕愈合情况，Image J软件分析计算水平迁移率。Transwell迁移实验：将两种细胞分别用含有不同浓度异鼠李素的无血清培养基重悬后，将细胞浓度调整为 2.5105个/mL，Transwell小室的上室加入200 L细胞悬液，下室加入600 L含10%胎牛血清的培养基，培养48 h，去除培养液，用甲醇溶液固定细胞30 min，再用0.5%结晶紫染色30 min，于显微镜下观察并拍照记录。1.6流式细胞术检测细胞凋亡在6孔板中分别接种SCC-9、SAS细胞（1106个/孔），培养 24 h 后，去除培养基；分组处理后，用无EDTA的胰酶消化、收集细胞，加入5 L Annexin V-FITC和5 L PI 轻轻吹打混匀，室温避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Flowjo软件分析计算细胞凋亡率。1.7Western blotting法检测PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转至 PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭 1 h，加入一抗PI3K110（1 1 000）、PI3K85（1 1 000）、AKT（1 1 000）、p-AKT（1 1 000）、mTOR（1 1 000）、p-mTOR（1 500）、S6（1 1 000）、p-S6（1 1 000）、GAP-DH（1 1