一种应对新冠变异株疫苗研制的免疫策略研究_母昌勇.pdf

第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023一种应对新冠变异株疫苗研制的免疫策略研究母昌勇#，彭晓武#，刘昌娥，郑丽春，李艳梅*（威瑞生物科技（昆明）有限责任公司，昆明 650201）摘要：利用序贯免疫具有较高中和效价以及较低副反应效果的特性，探讨一种具有 Wuhan株序列的小剂量 S1蛋白编码 mRNA 疫苗和具有变异株突变特征的蛋白疫苗的序贯免疫策略。制备自主设计序列的 mRNA 和蛋白疫苗，经测序，转录表达及抗原鉴定后免疫小鼠，分别检测不同免疫策略诱导的中和抗体、抗 S 蛋白 IgG 抗体以及特异性T 细胞增殖情况。实验用 mRNA 疫苗能够在 293细胞中有效翻译且呈现明显的量效关系；具有多种变异株突变位点的蛋白疫苗能够为患者恢复期血清和抗 S蛋白抗体所识别。两种疫苗组合经皮内和肌肉序贯免疫小鼠能够诱导较单剂免疫或同源加强策略更高的，包括中和抗体的抗体反应，其可以维持至加强免疫后的 140d。另外，其诱导的血清能够识别不同变异株的 S1 蛋白。序贯免疫诱导的特异分泌 IFN T 细胞增殖反应亦显示了类似的结果。mRNA/蛋白抗原组合疫苗进行序贯免疫的策略具有能够产生较高中和抗体、维持时间较长和易于针对不同变异株设计快速反应的优点，可以作为应对新冠变异株的候选疫苗策略。关键词：新型冠状病毒；序贯免疫；mRNA疫苗；蛋白疫苗中图分类号：R183.3 R373.1 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02032212DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004281始于 2019 年末，由 SARSCoV2 引起的、至今尚在全球肆虐的新冠疫情给人类的健康带来了极大的威胁1，2，亦同时推动了人们对公共卫生管理政策以及疫苗免疫策略和技术手段的深入认识3，4。在应对新冠疫情的疫苗研制过程脱颖而出的 mRNA疫苗技术5，6，为我们在研究推广不同疫苗免疫策略模式以及对不断出现的病毒变异株的工作提供了较好的技术支持。随着 SARSCoV2 变异株的不断出现，尤其是 Omicron 这一新的变异株所引起的大范围疫情，我们曾基于传统疫苗应用概念的免疫策略研发的、已上市的第一代新冠疫苗人群免疫屏障不得不面对不断被变异株感染所突破的挑战7，8。尽管从疫苗研发的角度看，我们的确对这一病毒感染个体的免疫学反应机理尚未有全面的了解，因此，疫苗抗原的选择结果亦有待不断优化，但现有的mRNA 和其它疫苗形式在不同免疫策略模式的研究亦提示，为了达到在人群中保持较高效价中和抗体以应对不断出现的病毒变异株 9，10，探索较多形式的疫苗免疫策略，加快对疫情的控制是具有积极意义的。一年多来全球应用不同疫苗应对疫情的实践表明，尽管各类疫苗都能在人群中产生相应的免疫保护力，也均各有特点，如 mRNA 疫苗可以引起较高效价的中和抗体，但其副反应较大，尤其是在多次免疫时11；而灭活疫苗和蛋白疫苗在表现较好安全性的同时，其免疫后的血清中和抗体相对较低，并有较快下降的趋势12，13。最近一些使用不同疫苗进行的序贯免疫研究表明，不同疫苗在合理的序贯免疫策略中的使用可以产生具有较高中和效价，以及较低的副反应的效果14，15。基于这样的背景，本文的工作探讨了一种具有 Wuhan 株序列的小剂量 S1蛋白编码 mRNA 疫苗和具有变异株突变特征的蛋白疫苗的序贯免疫策略，动物的免疫学分析结果表明，这一免疫策略具有能够产生较高中和抗体的优点和易于针对不同变异株设计快速反应疫苗的可能。材料与方法1 病毒与细胞新型冠状病毒 KMS2 株来自云南省传染病医院的 COVID19患者样本中分离（武汉株），在 Vero细胞中传代 3次后用于中和实验。293细胞和 CHO细胞购自美国 ATCC 公司，293 细胞于含有 10%牛血清的 DMEM 培养基中培养，CHO 细胞于无血清收稿日期：20220402；接受日期：20220922#共同第一作者：母昌勇和彭晓武作者简介：母昌勇（1995），男，从事核酸疫苗研发相关工作，Email：；彭晓武（1997），女，从事实验动物模型建立研究，Email：通讯作者：李艳梅（1966），研究员，主要从事病毒疫苗的研发工作，Email：开放科学（OSID）2期母昌勇，等.一种应对新冠变异株疫苗研制的免疫策略研究的专用培养基（购自美国 Thermo公司）中培养。2 抗体及试剂COVID19患者恢复期血清源自云南省传染病医院赠与。抗 S蛋白抗体购自北京义翘神州科技有限公司。pVAX 载体购自美国 Invitrogen 公司。针对变异株、plus株的 ELISA 试剂盒购自京天成生物技术（北京）有限公司，Elispot试剂盒及专用培养基购自达科为生物技术有限公司。mRNA 纯化 用 层 析 柱 购 自 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司（N1010），T7 体外转录试剂盒购自美国 NEB 公司（E2080S），递送系统为本公司开发的脂质体专利技术，包含阳离子脂质体及其它组份。蛋白用弱阴离子交换层析柱和 6FF 层析纯化柱购自美国 GE 公司。常规试剂为本公司保存。3 构建表达 mRNA实验疫苗基因的重组质粒合成含有武汉株（Genbank：MN908947.3）S1蛋白序列（无突变株突变位点）及武汉株 5UTR 和 3UTR 结构序列的 mRNA 疫苗基因序列，并在其后添 加 约 40 个 poly（A）插 入 pVAX 载 体 中，构 建pVAXS1 重组质粒。经酶切鉴定和序列测序证实重组质粒构建成功，以备后续实验需要。4 构建含有变异位点的 S1蛋白的真核表达质粒根据目前已知主要的南非、英国、印度等变异株关键变异位点，在武汉株 S1 基因序列的基础上，根据 Beta（南非变异株，B.1.351）、Delta（印度变异株，B.1.617.2）、和 Omicron（南非变异株，B.1.1.529）变异株设计了含有 10 个突变位点的 S1 蛋白序列（S110）。将该序列经双酶切（AvrII 和 BstZ17I）的方式插入真核表达载体 pCHO1 中，构建 pCHOS1 重组质粒。经酶切鉴定和序列测序证实重组质粒构建成功，以备后续转染需要。5 细胞转染转染前，弃除培养基更换为无血清无抗生素转染用培养基（购自美国 Thermo 公司）。使用转染用培养基将重组质粒稀释，并加入转染用试剂（购自美国 Thermo 公司）混匀，室温孵育 15min。将上述混合物小心加入 293 或者 CHO 细胞液中，混匀，放入37 5%CO2恒温培养箱中培养。6 具有变异位点的 S1蛋白实验疫苗抗原的制备收集培养了 3d的细胞培养物上清，经弱阴离子交换层析粗纯后，在经 6FF 层析纯化柱精纯，获得S1 蛋白（S110）。将经特异性鉴定 并 测 定 浓 度 的S110 蛋白（10g/剂）与铝佐剂（0.0175mg/剂）混合制备蛋白实验疫苗抗原。7 mRNA实验疫苗的制备将已构建好的表达 mRNA 实验疫苗基因的重组质粒 pVAXS1进行酶切，得到线性化 DNA 质粒，使用体外转录试剂盒（NEB 2080S）将 pVAXS1 重组质粒进行体外转录，并将试剂盒中的反应底物UTP 换为 N1me，根据试剂盒操作说明：10 T7 CleanCap Reagent AG Reaction Buffer、ATP、CTP、GTP、N1me、Cap Analog、T7 RNA Polymerase Mix各 2L，线性化重组质粒 pVAXS1 1g，用无菌无酶水补充至总体系 20L，轻轻混匀后于 37反应2h获得 IVT 反应产物并通过索莱宝的 RNA 专用纯化柱纯化，再用 70%的无水乙醇洗涤，最后用无核酶水洗脱得到初始 mRNA。随后通过酚氯仿抽提去除杂质、乙醇沉淀最终获得纯化后的 mRNA。以本公司的专利技术阳离子脂质体及其它组份，制备纳米脂质体颗粒。简言之，以胆固醇（DCCholera）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）及二硬脂酸磷脂酰乙醇胺聚乙二醇甘露糖（DSPEPEGMAN2000）为脂质材料，按照 4 1 1 的比例进行混合。用无水乙醇融合后用旋蒸仪得到脂质膜，用氮气干燥脂质膜，去乙醇残留，以海藻糖、SPAN85和去离子水溶解脂质膜，在磁力搅拌器上 80 1 200r/min 水合 1h 后得到脂质混合液。用购自 Avanti Polar Lipids，Inc.的脂 质 体 挤 出 器（Avanti miniextruder）、注 射 器（Syringe，1000L）和 0.2m、0.1m、0.05m 滤 膜（Polycarbonate membrane）分别来回推挤脂质混合液，每 次 1mL，获 得 脂 质 纳 米 颗 粒（lipid nanoparticles，LNP）。LNP 与上述获得的并经纯化的 mRNA 通过按一定配比包封制备 mRNA 实验疫苗，包封制备的 mRNA 疫苗使用包封率检测试剂盒（Quant iT RiboGreen RNA Reagent and Kit，Invitrogen）进行 mRNA 包封率检测，按操作说明书要求：分别配制 1TE Buffer 和含 2%Triton X100的 1TE Buffer用来稀释制备好的疫苗，梯度稀释标准品后通过与 RiboGreen RNA 染料结合后利用酶标仪在激发光 480nm 和发射光 520nm 处检测 OD值 并 绘 制 标 准 曲 线，分 别 算 出 游 离 mRNA 和 总mRNA 浓度，进而算出该实验 mRNA 疫苗的包封率96%。8 mRNA实验疫苗体外抗原表达鉴定将包封好的 mRNA 疫苗转染 293 细胞中，于转染后 24、48h 收集细胞培养物。使用细胞裂解液裂解细胞，制备免疫印迹检测用样品。323病 毒 学 报39卷9 免疫印迹（Western blotting）使用 12%SDSPAGE 分离重组蛋白，经电转将 蛋 白 转 移 到 聚 偏 氟 乙 烯（PVDF）膜 上。使 用TBST 制备 5%脱脂牛奶室温封闭 1h，洗涤 3 次，加入抗 S 蛋白的特异性一抗 4过夜孵育，洗涤 3 次，然后与带过氧化物酶（HRP）标记的二抗（抗 IgG（H+L）抗体）室温孵育 1h，洗涤 3次。最终，经 ECL超灵敏化学发光法将上述处理的 PVDF膜置于 BioRad凝胶成像仪中进行曝光和显色。10 动物伦理实验 Balb/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物方案经威瑞生物科技（昆明）有限责任公司动物伦理委员会审核批准（批准号：WRDWLL202105 001）。11 免疫程序与策略Balb/c 小 鼠 分 别 以 10g/100L/只 mRNA 实验疫苗经皮内或肌肉注射进行初次免疫，然后再用10g/100L/只的 S110 蛋白疫苗以与初免相同的途径进行加强免疫，二免时间为一免后第 2周或第 3周。同时设立皮内免疫一针剂或两针剂的 mRNA实验疫苗或 S110 蛋白疫苗的对照组（图 1）。各组分别于最后一次免疫后的第 1、2、4 周采集尾静脉血，分离血清，开展酶标抗体和中和抗体检测；分别于最后一次免疫后的第 6 和 20 周安乐处死一半小鼠，采集血液和脾脏，开展酶标抗体和中和抗体检测以及 IFN特异性的 Elispot检测（图 1）。整个实验过程中定期观察小鼠生存率、体重变化、和可能出现的临床症状。12 ELISA检测除商业化购置检测变异株、plus 株的ELISA 预包被检测试剂盒外，本实验还制备检测抗S 抗体的 ELISA 检测试剂盒。以包被稀释液稀释新冠病毒纯化的 S抗原（2g/孔，抗原购自上海三优生物医药有限公司）4 12h 包被空白 ELISA 板，并设置空白对照（PBS）和阴性对照（一抗为空白老鼠的 血 清）。然 后，弃 去 孔 中 液 体，加 入 200L（1%BSA，PBST 配置），4封闭过夜；用洗涤液清洗 3 次。