遗传代谢病检测技术及应用选择_韩连书.pdf

81 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023遗传代谢病检测技术及应用选择韩连书上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所 儿内分泌遗传代谢科（上海 200092）摘要：罕见病中的遗传代谢病是由于机体代谢过程中基因变异引起相关酶活性降低或缺乏导致底物蓄积及产物减少，引起机体生化代谢紊乱而产生一系列临床症状的一类疾病。近年来，关于遗传代谢病筛查检测技术不断更新，越来越多的遗传代谢病患者得到确诊和及时治疗，缩短了发病到治疗的时间，提高了治疗效果。文章主要介绍荧光免疫技术、串联质谱技术、气相色谱质谱技术、基因测序技术、染色体检测技术及应用选择，以提高临床医师对这些技术的了解。关键词：遗传代谢病；串联质谱；气相色谱质谱；基因检测Detection technology and application selection of genetic metabolic diseases HAN Lianshu(Department of Endocrinology and Genetic Metabolism,Xinhua Hospital,Shanghai Institute for Pediatric Research,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China.)Abstract:Inherited metabolic diseases among rare diseases,also known as inborn errors of metabolism,refer to the enzymes,receptors,and cell membrane dysfunctions involved in and caused by genetic defects.These diseases lead to the blockage of metabolic pathways,and an accumulation of intermediate,bypass products,or a lack of terminal products,resulting in a variety of clinical symptoms.In recent years,the advances in detection techniques have enabled a larger number of patients to be diagnosed and treated timelier,shortening the time from disease onset to treatment and improving the quality of outcomes.This article focuses on fluorescence immunoassay techniques,tandem mass spectrometry,gas chromatography-mass spectrometry,gene sequencing,chromosome detection techniques and options of techniques above for inherited metabolic diseases to improve clinicians understanding.Key words:inherited metabolic disease;tandem mass spectrometry;gas chromatography-mass spectrometry;gene detectiondoi:10.12372/jcp.2023.22e1461 述 评 罕见病种类繁多，包括各种器官畸形、综合征及功能缺陷疾病。遗传代谢病（inherited metabolic disease，IMD）又称先天性代谢异常（inborn errors of metabolism,IEM），属于功能缺陷型罕见病，是由于基因变异引起维持正常代谢所必需的酶、受体、载体等蛋白功能缺陷，导致中间或旁路代谢产物蓄积或终末代谢产物缺乏，引起一系列临床症状的一类单基因遗传病1。大部分IMD属于常染色体隐性遗传，总体发病率约1/50001/14002。IMD临床表现复杂，缺乏特异性，全身各器官均可受累。其分类方式多样，如根据代谢物可分为氨基酸代谢异常、碳水化合物代谢异常、脂肪酸氧化障碍、尿素循环障碍、有机酸代谢异常、维生素代谢异常及金属元素代谢障碍等3；根据受累的细胞器可分为溶酶体病、线粒体病及过氧化物酶体病等。IMD种类繁多，涉及体内代谢途径广泛，病因复杂，其确诊和分型依赖各种检测。常规生化检测如血常规、尿常规、血糖、肝功能、肾功能、电解质、血气分析、血氨、乳酸及肌酸激酶等项目出现异常，不能确定某种疾病，但可为IMD的诊断提供线索，判断病情程度。如血肌酸激酶增高，则需要鉴别是否为脂肪酸氧化代谢病、肌营养不良及甘油酸激酶缺乏症等。基金项目：上海市卫健委科研项目（No.202140346）,国家重点研发计划（No.2016YFC0901505）82 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.20231 特殊生化检测技术1.1 免疫荧光检测技术免疫荧光检测技术包含化学发光免疫分析法和放射免疫分析法。其中化学发光免疫分析法广泛用于新生儿筛查中促甲状腺素、17-羟孕酮、苯丙氨酸、葡萄糖6-磷酸脱氢酶检测。该技术还可通过在外周血白细胞或羊水细胞加入底物，计算产物与底物的比值得出酶活性，作为诊断溶酶体贮积病的金标准，如戈谢病需检测-葡糖苷酶活性、法布累病应检测-半乳糖苷酶活性、尼曼皮克病需检测酸性鞘磷脂酶活性，且酶活性检测是黏多糖贮积病分型的重要依据2。现已有部分地区开始利用此技术进行新生儿溶酶体疾病的筛查4。另外该技术也广泛应用于四氢生物蝶呤还原酶缺乏症、生物素酶缺乏症及酮氧化酶缺乏症等疾病的诊断。1.2 串联质谱检测技术串联质谱技术(tandem mass spectrometry,MS/MS)因其特异性高、同时准确区分及定量多种代谢物等特点，可用于遗传代谢病的筛查、诊断及治疗随访检测。该技术通过检测滤纸干血斑中氨基酸、酰基肉碱、同型半胱氨酸及不同类型类固醇激素等物质的质荷比（质量数/所带电荷数）对其进行定性及定量分析5，其优点在于检测方法快速、特异性强，可在23分钟内对1个3 mm滤纸干血斑中几十种代谢产物进行分析，对多种氨基酸、有机酸、脂肪酸氧化代谢紊乱的疾病及类固醇激素相关代谢病进行新生儿筛查、临床患者的诊断及鉴别诊断。该项技术除了可实现一个血斑一次实验检测多种疾病6，并可设置相关氨基酸及酰基肉碱间的比值，进一步降低检测的假阳性率和假阴性率。1990年美国Millintong等5首次将此技术用于IMD的检测。2002年上海新华医院率先将其应用于新生儿疾病筛查及临床患者检测7，目前串联质谱技术已广泛用于新生儿氨基酸代谢障碍、有机酸血症、脂肪酸氧化代谢障碍、先天性肾上腺皮质增生症、溶酶体疾病及X-连锁肾上腺脑白质营养不良的筛 查8-11，并形成了新生儿疾病串联质谱筛查技术专家 共识12。1.2.1 血氨基酸谱检测 氨基酸水平测定是诊断IMD的重要方法，尤其是与氨基酸代谢障碍相关。但血液中氨基酸水平受诸多因素影响，包括年龄、营养状况、生理变化、疾病及治疗情况等，因此氨基酸结果分析应结合临床进行综合评估。部分氨基酸代谢病患者尿中特异的有机酸可增高，因此血中某些氨基酸增高结合其相应的尿有机酸增高更有助于诊断。如酪氨酸血症不仅血酪氨酸、酪氨酸与苯丙氨酸比值增高，同时尿4-羟基苯乳酸和4-羟基苯丙酮酸也可增高。1.2.2 酰基肉碱谱检测 酰基肉碱是脂肪酸、有机酸代谢的中间产物，多种脂肪酸和有机酸代谢异常均伴有肉碱和酰基肉碱的改变。如血游离肉碱降低可提示原发性肉碱缺乏或继发性肉碱缺乏，其水平显著降低常见于原发性肉碱缺乏症；而轻度降低则多继发于营养不良、长期素食、反复呕吐、腹泻或其他疾病消耗肉碱所致，如有机酸血症和脂肪酸氧化代谢病等。临床疑似有机酸血症或脂肪酸氧化代谢病时首选串联质谱检测。另外，串联质谱检测羊水酰基肉碱水平可用于判断胎儿是否患有有机酸血症，故有机酸血症的产前诊断可利用串联质谱检测羊水酰基肉碱水平13。1.2.3 类固醇激素谱检测 目前类固醇激素的测定主要采用各种不同的免疫分析方法，但由于各种类固醇激素在体内水平极低，一般检测水平在nmol/L 或pmol/L数量级，上述方法虽能达到一定准确度，但仍存在不同激素间的交叉反应、敏感度和特异度不高14-15。串联质谱技术通过检测不同激素间质荷比进行定性，可有效降低假阳性率，提高阳性预测值，广泛用于新生儿先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）的二级筛查16。此外，串联质谱技术通过检测不同种类类固醇激素水平，还可筛查除21-羟化酶缺乏症外的其他CAH类型17。1.2.4 同型半胱氨酸检测 同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）通常是利用循环酶法检测,但其高水平的内源性物质对测定结果有较大干扰。高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）由于具有高敏感性、特异性及准确性，且能更精确地测定各类同型半 83 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023胱氨酸水平，近年来已被用于总Hcy的临床检测18。1.2.5 溶酶体酶活性检测 溶酶体酶活性检测主要用于溶酶体贮积病（lysosomal storage disorders,LSDs）临床疑似患者的诊断及新生儿筛查，检测方法包括串联质谱法、荧光法和多免疫定量法。荧光法因每次实验只能检测一种酶活性，多免疫定量法因尚未商品化还难以推广19-20。串联质谱技术可根据酶反应产物和内标特征离子对定量，得到产物与内标的信号强度比值，从而计算出酶活性，每次用1个干血斑样本可同时检测6种酶活性，包括酸性-葡萄糖脑苷脂酶、酸性鞘磷脂酶、-半乳糖脑苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、a-半乳糖苷酶和酸性a-葡糖苷酶，具有较好的灵敏度和准确度，更适用于开展高通量的新生儿LSDs筛查21。1.2.6 极长链脂肪酸检测 血清极长链脂肪酸（very long chain fatty acids,VLCFAs）定量检测是诊断X-连锁肾上腺脑白质营养不良（X-linked-adrenoleukodystrophy,X-ALD）最主要的生化方法。国内多采用衍生化的质谱方法检测二十二碳脂肪酸(C22:0)、二十四碳脂肪酸(C24:0)、二十六碳脂肪酸(C26:0)水平以及C24:0/C22:0比值、C26:0/C24:0比值22。近年来通过非衍生化的串联质谱技术检测滤纸干血片中极长链酰基肉碱（very long chain acylcarnitine,VLCAC）和溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine,LPC）可极大缩短每份样本的检测时间，精密度和准确性较好，适合高通量的新生儿筛查。目前，国际上多采用LPC（特别是C26:0-LPC）作为X-ALD的筛查指标23。但研究表明C26和C26/C22比值更适合作为我国诊断X-ALD的生物标志物11。1.3 气相色谱质谱检测气相色谱质谱技术（gas chromatography-mass spectrometry,GC/MS）是通过检测尿液中有机酸质荷比对其进行定性及定量分析，可为40多种IMD的诊断提供可靠依据，是目前常用的IMD检测方法之一24。自1966年Tanaka等25首次通过GC/MS检测尿有机酸谱诊断异戊酸血症，G