阳合汤对哮喘模型动物的抗炎作用及靶点研究_叶超雄.pdf

论著阳合汤对哮喘模型动物的抗炎作用及靶点研究叶超雄，何晓亮，萧丽芬，张色华，李俊雄，汪颖，熊天琴（广东省中西医结合医院，广东 佛山；广州中医药大学中药学院，广东 广州；广州中医药大学第一附属医院，广东 广州；佛山市南海区桂城医院，广东佛山）摘要：目的 信息学分析及动物实验验证相结合的方法，探讨经验方阳合汤治疗哮喘的潜在靶点和信号通路，为该方的进一步开发提供实验数据。方法 通过网络药理学分析筛选阳合汤治疗哮喘的核心靶点和通路。在此基础上进行动物实验验证。雄性 大鼠于第、天腹腔注射 致敏液，周后 鼻孔 激发，每天 次，持续 周。首次致敏 后给予相应药物，激发结束 内进行取材。检测炎症和免疫指标，观察肺组织、表达情况。结果 基于数据库筛选出、等 个核心靶点，富集分析获得 等 条信号传导途径。动物实验结果显示，阳合汤升高模型组动物降低的胸腺指数，降低模型组动物升高的脾指数；降低血清、升高肺泡灌洗液中、含量；降低肺组织匀浆中 含量，升高 含量；使得肺组织中肺泡腔扩大、肺泡壁增厚情况明显改善，炎症细胞减少。降低肺组织中 和 的表达。结论 阳合汤能有效减轻大鼠的哮喘，其机制可能与调节 通路有关。关键词：哮喘；阳合汤；网络药理学；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：基金项目：佛山市自筹经费类科技计划项目（）作者简介：叶超雄，副主任中药师，研究方向：名医方药搜集整理、中药处方点评、经方药物制用研究通信作者：熊天琴，教授，研究方向：中药作用机制及物质基础，：，（，；，；，；，）：（），；，：；，今日药学 年 月第 卷第 期 哮喘（）是一种能控制不能根治的慢性疾病，随着环境气候的变化，哮喘极易复发，严重影响患者正常学习、工作、生活，然而目前的治疗方法不能满足哮喘患者对该疾病的多样化需求。因此，阐明哮喘的确切发生机制及开发新的药物成为目前的研究重点以及亟待解决的问题。阳合汤由“广东省名中医”李俊雄教授研发，由蛤蚧、淫羊藿、山药、五指毛桃、墨旱莲组成。近 年来，该方已被广泛应用于肾阳虚型支气管哮喘的临床治疗，疗效显著，但其作用机制尚不明确。本研究旨在信息学分析指导下，结合哮喘动物模型的效果，探讨该方治疗作用及潜在靶点，为阳合汤更好地合理应用于临床提供理论基础，为该方进一步开发提供实验数据。材料 实验动物 只雄性 大鼠（体质量 ，周龄，级）购于广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：（粤），于广州中医药大学中药学院使用许可证号：（粤）级环境中饲养，控制饲养温度（）、湿度、光照与黑夜交替，自由获取水和食物。动物适应性饲养 周后进行实验。动物实验符合广州中医药大学动物实验伦理审查条例要求。主要药物与试剂阳合汤中药组成：蛤蚧粉 、淫羊藿 、白术、五指毛桃 、墨旱莲 。药材由广东省中西医结合医院提供，经生药学鉴定为合格药材。卵清蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：）；氢氧化铝佐剂（美国 公司，批号：）；地塞米松片（广东南国药业有限公司，批号：）；多聚甲醛通用型 组 织 固 定 液（美 国 公 司，批 号：）；试剂盒（、，上海酶联生物科技有限公司，批号：）；测试盒、测试盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批号：、）；抗体、抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：、）。主要仪器 全波长酶标分析仪（美国 公司）；流式细胞仪（美国 公司）；兽用全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。方法 网络药理学分析 数据库及软件 中药系统药理学数据库与分析平台（：），数据库（：）；数据库（：），网站（：），数据库（：），数据库（：），软件（：）。阳合汤活性成分及作用靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（），以阳合汤各味药为关键词进行检索，在 项下设置口服生物利用度（，），类药性（，）为条件筛选其活性成分，在 项下得到对应靶点，通过 数据库进行注释。哮喘疾病靶点筛选在 数据库中以“”为关键词，检索并整理得到哮喘疾病靶点。阳合汤哮喘蛋白质互作网络构建与分析在 网站分别导入阳合汤靶点和哮喘靶点，获得阳合汤治疗哮喘潜在靶点。将潜在靶点导入 数据库，进行蛋白质蛋白质相互作用分析，将结果导入 软件使其可视化。根据 值从大到小，自内而外排列，以 倍节点度值（）的中位数为最低标准筛选出核心靶标蛋白。阳合汤核心靶点 功能分析和 富集分析将核心靶点导入 数据库中，选择物种为 ，对靶点进行 和 注释。选择 对 功能和富集的 通路进行排序，选择 个主要功能和通路绘图，为有统计学意义。药物制备除蛤 蚧 粉 外 其 余 中 药 饮 片 以 蒸 馏 水 浸 泡，加热煮沸后改文火煎 ，倾倒出药液，残渣过滤后复煎，两次药液合并分别浓缩，蛤蚧粉按比例冲服。阳合汤低剂量浓度为 、中剂今日药学 年 月第 卷第 期，量 、高剂量 ，此为按体表面积等效剂量法进行人与大鼠给药剂量折算，分别相当于成人临床剂量的 倍、倍、倍。动物分组、造模给药及取材 只雄性 大鼠适应性喂养 后，随机分为 组，分别为正常对照组、模型组、阳合汤低剂量组、阳合汤中剂量组、阳合汤高剂量组、地塞米松组。参考相关文献模拟大鼠哮喘模型，除正常对照组外，其余各组于第、天腹腔注射 致敏液 生理盐水含 ，（），正常对照组给予等量生理盐水；致敏结束 周后，除正常对照组外，其余各组 鼻孔 激发液 生理盐水含 ，（）滴鼻，每天 次，持续 周。阳合汤组于首次致敏 后给予阳合汤灌胃治疗，每天 次；地塞米松组于首次激发 后给予地塞米松（，生理盐水溶解）灌胃治疗，每天 次；正常对照组、模型组给予生理盐水灌胃治疗。最后 次激发后 进行最后 次灌胃治疗。激发结束 内进行取材。实验期间观察和记录大鼠一般形态学情况，以大鼠出现气急喘促、腹式呼吸、口鼻发绀、烦躁不安、易怒等，提示造模成功。腹主动脉取血，分离血清，根据酶联免疫吸附法检测大鼠血清 水平。取胸腺、脾，称重，与大鼠体质量比，计算免疫器官指数。免疫器官指数免疫器官重量 体质量。采集肺泡灌洗液进行血细胞计数分析及酶联免疫吸附法检测、水平。制备肺组织匀浆，生化法检测、水平。肺组织病理学观察。免疫组化法观察肺组织 和 的表达。统计学处理方法实验数据采用 进行单因素方差分析（），并以均数标准差（）表示。若未满足方差齐性则用 检验。为差异有统计学意义。结果 网络药理学分析结果阳合汤成分靶点结果采用 数据库筛选阳合汤潜在活性靶点，其中蛤蚧 个、淫羊藿 个、白术 个、五指毛桃 个、墨旱莲 个，合并删除重复项得到阳合汤靶点 个，并通过 数据库校正为标准基因名称。哮喘疾病靶点结果通过 数据库，输入检索词“”获得靶点 个，作为哮喘疾病相关靶点。阳合汤哮喘靶点互作将阳合汤成分潜在作用靶点与哮喘相关靶点于 网站取交集，找到共同的蛋白靶点，共 个，见图。哮喘靶点阳合汤靶点4 5 1 44 5 72 4 9注：左侧为哮喘靶点，右侧为阳合汤靶点，两圆相交部分为共有的靶点。图 阳合汤与哮喘的靶点交集 图将所得的共同靶点基于 平台进行 网络的绘制，将所得结果在 软件中可视化。节点以椭圆形表示，值越大，则节点形状越大且颜色越深。根据 值从大到小，自内而外排列，以 倍 值的中位数为最低标准筛选出核心靶标蛋白。核心靶点包括、等 个，见图。注：左侧为前 个核心靶点，深色表明较高重要性，浅色表明较低重要性。图 阳合汤治疗哮喘潜在靶点 网络，今日药学 年 月第 卷第 期 阳合汤核心靶点 功能分析和 富集分析通过 功能分析，获得生物学过程（）个条目，细胞组分（）个条目，分子功能（）个条目，以 为标准进行筛选后，选择 个主要条目以条形图呈现。阳合汤治疗哮喘主要涉及对药物的反应、对异种刺激的反应、蛋白激酶 信号的正向调节、细胞对缺氧的反应、细胞对活性氧的反应、细胞对机械刺激的反应、细胞对肿瘤坏死因子的反应、磷脂酰肌醇 激酶信号、炎症反应、转化生长因子 受体信号通路等生物学过程。分子功能主要涉及蛋白丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸激酶活性、蛋白激酶结合、转录因子结合、受体结合、转录辅助因子结合、整合素结合、磷脂酰肌醇 激酶结合、大分子复合物结合、类固醇结合、生长因子结合等，见图。图 阳合汤治疗哮喘的核心靶点 功能分析结果通过 富集分析，获得通路（）条，以 为标准进行筛选后，选择主要 条富集结果以气泡图呈现。富集结果分析显示阳合汤治疗哮喘的通路主要涉及 信号传导途径、脂质和动脉硬化、信号传导途径、黏着斑、信号通路、细胞受体信号传导途径、信号传导途径、信号传导途径、细胞分化、信号传导途径等，见图。阳合汤对哮喘大鼠免疫器官指数的影响如表 所示，阳合汤能明显升高胸腺指数，降低脾指数。阳合汤对哮喘大鼠血清 含量的影响如表 所示，阳合汤明显降低血清 含量。图 阳合汤治疗哮喘的核心靶点 富集分析结果表 阳合汤对哮喘大鼠免疫器官指数的影响（）组别胸腺指数 脾指数 正常对照组 模型组 阳合汤低剂量组 阳合汤中剂量组 阳合汤高剂量组 地塞米松组 注：组，组，组，组，。表 阳合汤对哮喘大鼠血清 含量变化（）组别 正常对照组模型组 阳合汤低剂量组 阳合汤中剂量组 阳合汤高剂量组 地塞米松组 注：组，组，组，。阳合汤对哮喘大鼠肺泡灌洗液中白细胞和淋巴细胞数量及炎症因子含量的影响 如表 所示，阳合汤降低肺泡灌洗液中白细胞和淋巴细胞数量。如表 所示，阳合汤降低肺泡灌洗液中、含量。表 阳合汤对哮喘大鼠白细胞和淋巴细胞数量的影响（）组别白细胞 淋巴细胞 正常对照组模型组阳合汤低剂量组阳合汤中剂量组阳合汤高剂量组地塞米松组注：组，组，。今日药学 年 月第 卷第 期，表 阳合汤对哮喘大鼠、含量（）组别 正常对照组模型组阳合汤低剂量组阳合汤中剂量组阳合汤高剂量组地塞米松组注：组，组，组，组，组，。阳合汤对哮喘大鼠肺组织脂质过氧化的影响如表 所示，阳合汤降低肺组织匀浆中 水平、升高 水平。表 阳合汤对哮喘大鼠、的影响（）组别（）（）正常对照组模型组阳合汤低剂量组阳合汤中剂量组阳合汤高剂量组地塞米松组注：组，组，组，组，。阳合汤对哮喘大鼠肺组织病理结构的影响如图 所示，正常对照组大鼠肺组织支气管绒毛排列整齐，未见平滑肌层及管壁增厚，无明显的炎症细胞浸润。模型组大鼠肺组织支气管壁平滑肌增厚，肺泡腔扩大，肺泡壁增厚，壁周围炎性细胞浸润。给予药物治疗后肺泡腔扩大、肺泡壁增厚情况明显改善，炎症细胞减少。阳合汤对哮喘大鼠肺组织 通路的影响 棕黄色为 、阳性表达细胞。、的表达在对照组中呈弱阳性，而在模型组中则显著增强，给予阳合汤和地塞米松治疗后，和 的表达有不同程度的降低，见图。A.正常对照组B.模型组C.地塞米松组D.阳合汤低剂量组E.阳合汤中剂量组F.阳合汤高剂量组 2 0 0 2 0 0图 各组大鼠肺组织病理学变化（染色），今日药学 年 月第 卷第 期 4 0 0 4 0 0A.正常对照组B.模型组C.地塞米松组D.阳合汤低剂量组E.阳合汤中剂量组F.阳合汤高剂量组图 各组大鼠肺组织 表达水平 4 0 0 4 0 0A.正常对照组B.模型组C.地塞米松组D.阳合汤低剂量组E.阳合汤中剂量组F.阳合汤高剂量组图 各组大鼠肺组织 表达水平 讨论过敏性哮喘是最常见的哮喘形式，是由吸入过敏原引起的，过敏原会引发过敏人群免疫系统的过度反应。过敏性哮喘患者气道中的炎症特征包括辅助型 细胞（，）相关细胞因子的产生，肥大细胞的激活，嗜酸性粒细胞的活化和浸润，免疫球蛋白（）的增加。被刺激和炎症激活，激活的（）使 磷酸化，然后激活，促进蛋白质翻译和细胞生长。另一方面，在哮喘中被高度激活，的激活也有类似现象。信号对气道平滑肌的增今日药学 年 月第 卷第 期，殖很重要，阻断可以抑制哮喘的气道重塑。经网络药理学分析结果显示，阳合汤治疗哮喘的核心靶点包括、等 个。对靶点进行 和 注释。结果分析显示阳合汤治疗哮喘的生物学过程主要涉及对药物的反应、对异种刺激的反应、蛋白激酶 信号的正向调节、细胞对缺氧的反应、细胞对活性氧的反应、细胞对机械刺激的反应、细胞对肿瘤坏死因子的反应、磷脂酰肌醇 激酶信号、炎症反应、转化生长因子 受体信号通路等。分子功能主要涉及蛋白丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸激酶活性、蛋白激酶结合、转录因子结合、受