阳春砂2个蒎烯合酶的催化功能和表达模式比较_凌旭怡.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家自然科学基金面上项目（）通信作者杨锦芬，研究员，研究方向为药用植物萜类药效物质生物合成和代谢工程，：作者简介 凌旭怡，硕士研究生，研究方向为药用植物萜类药效物质生物合成和代谢工程，：分子生药学 阳春砂个蒎烯合酶的催化功能和表达模式比较凌旭怡，林晓静，黄琳璇，杨鹏，杨锦芬（广州中医药大学 中药学院 岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州）摘要 阳春砂果实中含有丰富的挥发性萜类，其中蒎烯是其主要成分之一，且具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等广泛的药理活性。课题组前期通过 检测发现阳春砂果实中含有丰富的 蒎烯，且克隆并鉴定了以 蒎烯为主产物的萜类合酶（，原名），但以 蒎烯为主产物的萜类合酶还未被鉴定。该研究基于阳春砂基因组数据，筛选发现与 序列高度相似的，并对 进行体外酶功能鉴定及与 进行序列、催化功能、表达模式及启动子比较分析。多序列比对表明 与 的氨基酸序列高度相似且萜类合酶的保守 基本一致。体外催化功能比较显示两者均能生成蒎烯，其中 主产物为 蒎烯，而 的主产物为 蒎烯。表达模式分析显示 主要在花中高表达，在全株均有表达，且在果皮中表达量最高，表明其可能主要负责果实中 蒎烯的合成。此外，对 与 启动子的分析显示二者启动子区域存在多个与胁迫响应相关的调控元件。以上研究结果可为萜类合酶基因的功能研究提供参考，也可为蒎烯的生物合成提供新的基因元件。关键词 阳春砂；蒎烯合酶；蒎烯；功能鉴定；表达模式 ，（，），（，），凌旭怡等：阳春砂 个蒎烯合酶的催化功能和表达模式比较 ；：.阳春砂 （曾用名 ）是“四大南药”砂仁的主要来源植物，以干燥成熟果实入药，味辛，性温，现代药理研究表明具有温脾止泻、化湿开胃、理气安胎的功效，主治恶心呕吐、腹泻、脘腹胀满、胎动不安等。阳春砂的功效归功于其含有丰富的挥发油，挥发油的主要成分包括乙酸龙脑酯、龙脑、樟脑、柠檬烯、蒎烯等萜类化合物。蒎烯是一种重要的天然单萜类化合物，分为蒎烯和 蒎烯 种不同异构体，具有多种药理活性，如 蒎烯具有抗炎活性、软骨保护活性和抗肝癌活性，蒎烯具有抗真菌活性。此外，蒎烯还具有多种生物学功能，如 蒎烯抑制松材线虫存活率，减少松材线虫对松树的侵染；在云杉树遭受昆虫侵害后 蒎烯和 蒎烯含量显著增加，表明蒎烯是云杉直接防御系统的重要组成成分；罗汉果雄株释放雌株不含有的 蒎烯和 蒎烯，这暗示蒎烯可能起到吸引传粉昆虫帮助罗汉果授粉的作用。蒎烯在阳春砂各组织部位中广泛分布，其中蒎烯主要在叶片、花和药用部位果实中富集，蒎烯则主要在叶片和花中富集。此外，与叶片的健康部位相比，阳春砂叶片病变部位的 蒎烯、蒎烯含量均有提高，这可能与抗病相关。蒎烯合酶（，）是一类能够催化香叶基焦磷酸（，）生成蒎烯的萜类合酶（，）。由于蒎烯在植物中广泛分布，已在植物中发现多个蒎烯合酶，如台湾柳杉 的 能够催化 生成主产物 蒎烯，桉树 的 能 够 生 成 蒎 烯 和 蒎烯，以及思茅松 的 蒎烯合酶（）生成蒎烯等。本课题组前期对阳春砂的 进行了挖掘和功能鉴定，已克隆和鉴定了 个蒎烯合酶（），其催化 生成的主产物为 蒎烯，其次是 蒎烯。近期，本课题组完成了阳春砂的基因组测序（登录号），并且基于生物信息学鉴定了阳春砂 基因家族的 个成员，其中已鉴定功能的 对应的是。对阳春砂 基因家族 个成员的聚类分析结果显示 与 的聚类关系较近，并且具有与 高度相似的氨基酸序列。为了进一步探究阳春砂中蒎烯的合成机制，挖掘其中以 蒎烯为主产物的，本研究对 进行克隆和功能鉴定，并与 进行催化产物和表达模式的比较，以及生物信息学相关的氨基酸序列、保守、启动子调控元件的分析，可为相似基因的功能比较，以及不同构型蒎烯的生物合成提供依据。材料阳春砂 栽种于广州中医药大学时珍山（由广州中医药大学何国振教授鉴定），取其果实保存至 冰箱。（）原核表达载体由本实验室保存；大肠杆菌、（）和 零背景快速克隆试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；购于宝日医生物技术有限公司；为广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心幸尚平博士合成；（羟乙基哌嗪乙磺酸，德国）；（二硫苏糖醇）购于北京索莱宝科技有限公司。方法.的提取与反转录使用 植物 提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司），参照说明书的方法提取果皮的总。用 合成试剂盒天根生化科技（北京）有限公司，参照说明书的方法，对提取的总 进行反转录。.基因的克隆 使用 软件对 的编码区序列设计特异性克隆引物（表），以 作为模板，用 高保真酶扩增序列，扩增程序参考李萌等使用的程序。产物经琼脂糖凝胶电泳验证后使用 回收试剂盒，按说明书回收 产物。将回收产物按照 零背景快速克隆试剂盒说明书的方法构建重组克隆载体，将重组克隆载体转入 大肠杆菌后送至北京擎科生物有限公司测序。.原核表达载体构建将 氨基酸序列提交到 （：）在线网站预测质体转运肽，根 年 月第 卷第 期.，.，表 本实验所用引物 引物名称引物序列（）引物功能基因克隆 基因克隆 构建表达载体构建表达载体据 引物设计原则对截去质体转运肽的 设计 载体同源臂引物（表）。用同源臂引物对片段进行 扩增，将扩增片段连接到 表达载体，再将重组表达载体 转入 大肠杆菌后送至北京擎科生物有限公司测序。.与 原核表达与蛋白纯化 原核表达载体为本课题组王虹所构建并转入 保存于。将 重组质粒转入至 中，对 和 进行蛋白诱导和纯化。蛋白诱导方法参照文献进行，使用 柱子收集蛋白，并用 咪唑洗去杂蛋白，用 咪唑洗下目的蛋白，最后用 柱进行脱盐处理，脱盐 的组成成分为 、和 ，.。.体外酶促反应及产物测定以 为底物，对重组蛋白 和 进行体外酶促反应，取 纯化蛋白，加入过量，用脱盐 补足体积至 ，反应 后，用 正己烷萃取。采用美国安捷伦 气象色谱质谱联用仪（）对产物进行分析，每个样品均做 次重复，化合物结构和名称通过 质谱库和对照品比对确定，产物百分比通过提取峰面积进行计算。.表达模式与产物相关性分析利用课题组已有 的 阳 春 砂 转 录 组（登 录 号）表达量和萜类含量数据，采用 软件对 和 的表达量和种子团、果皮、花、叶以及根状茎的蒎烯含量进行作图分析。.序列比较分析使用（：）在 线 网 站 对 和 的物理性质进行分析。使用.（：？.）在线网站预测 转运肽，使用 软件对 和 进行序列比对分析及萜类合酶保守位点比较分析。.启动子分析 选取 和 上游 序列作为其启动子顺式作用元件，使用（：）在线网站对 和 的启动子顺式调控元件进行初步分析。.蒎烯合酶关键位点分析通过查阅相关文献并从（：）在线网站下载已发表的蒎烯合酶序列，与 和 进行序列比对，对萜类合酶关键位点进行分析。结果.的克隆基于阳春砂基因组数据筛选了 个 家族成员，其中与已知基因 序列高度相似的 开放阅读框全长 。根据 编码区设计引物，以果皮 为模板，通过 得到 条约 的条带（图），长度符合预期，构建 重组克隆载体并进行测序，测序结果显示与基因组中 序列一致，确认克隆成功。图 的 扩增条带.凌旭怡等：阳春砂 个蒎烯合酶的催化功能和表达模式比较.与 的序列比较分析多序列比对结果显示 与 分别编码、个氨基酸，相对分子质量分别为 .、.，等电点分别为.、.，二者均为不稳定的疏水蛋白。在 端预测有全长 个氨基酸的转运肽，而 的转运肽预测含有 个氨基酸。与 截去转运肽后，剩余氨基酸序列的一致性为.，二者均具有萜类合酶的保守，其中、完全一致，在 处有一个差异位点（图）。图 和 保守 分析.原核表达和蛋白纯化从大肠杆菌表达菌株中提取纯化获得的重组蛋白经 检测可见介于 的单一条带（图），的目的条带约为 ，的目的条带约为，纯化蛋白符合预期大小。.体外酶功能鉴定与比较分析以 为底物，能够催化生成 蒎烯、蒎烯、柠檬烯和异蒲勒醇 种单萜类化合物，能生成蒎烯、蒎烯、柠檬烯和枞油烯。和 催化产物种类相似（图），但产物选择性不同，以蒎烯为主产物且在催化产物中占比（图），而 以 蒎烯为主产物，占所有产物的（图）；因此，更名为蒎烯合酶（，），更名为 蒎烯合酶（，）。年 月第 卷第 期.，.，图 与 蛋白纯化电泳.酶活产物 分析；酶活产物百分比；蒎烯；枞油烯；蒎烯；柠檬烯；异蒲勒醇。图 与 体外酶活产物分析与比较.蒎 烯 合 酶 关 键 位 点 分 析 将 和 与其他已发表的 及阳春砂芳樟醇合酶（，）进行多序列比对分析（图）。已报道的具有蒎烯高选择性的 催化生成蒎烯的关键位点是，与之相应的位点是，而 对应的位点则是。此外比对结果显示，具有催化生成蒎烯功能的（或），此位点均为（）或（）。.表达模式与产物相关性分析 在阳春砂全株均有表达，其中果皮中的表达量最高，在叶片和根状茎中表达量较低，而 在种子团中不表达，在花与根状茎中表达量稍高（图）。蒎烯在红框内为 催化生成蒎烯的关键位点；蒎烯合酶；蒎烯合酶；芳樟醇合酶；火炬松 ；扭曲松 ；班克松 ；北美云杉；绿薰衣草 ；台湾红桧；芍药 ；阳春砂 。图 蒎烯合酶关键氨基酸位点比较.阳春砂全株均有分布，在叶片、花、果皮和种子团中含量较高，蒎烯在叶片、果皮以及花中含量较高（图）。结合、在各器官部位的表达量与蒎烯在阳春砂各器官部位的含量，推测 可能是果皮、种子团和花中负责蒎烯合成的关键酶，与 协同参与了除种子团外其他器官部位的蒎烯合成。.启动子分析 对 和 启动子的顺式作用元件预测结果显示，在二者的启动子区域存在胁迫响应相关的调控元件。与 启动子区域存在多个参与光响应相关的元件和茉莉酸甲酯响应相关的元件。此外，的启动子区域存在 个参与缺氧特异性诱导的元件和 个脱落酸响应元件，启动子区域则存在 个与分生组织表达相关的顺式作用调控元件及 个赤霉素应答元件（图）。讨论本论文鉴定了阳春砂中的一个以蒎烯为主产物的蒎烯合酶 （），并且将其与阳春砂中以 蒎烯为主产物的另一个蒎烯合酶（）进行比较，发现它们的催化产物、氨基酸位点和启动子调控元件均具有差异。的催化产物与活性关键位点息息相关，如大冷 杉 的 蒎 烯 合 酶 和 莰 烯 合 酶（，）有高度相似的氨基酸序列，凌旭怡等：阳春砂 个蒎烯合酶的催化功能和表达模式比较 与 在各组织部位的表达量（果实生长期为开花后 ）；蒎烯与 蒎烯在各组织部位的含量分布情况（果实生长期为开花后 ）。图 与 表达模式及产物相关性分析（?，）.（?，）图 和 启动子的调控元件.但其活性口袋附近的催化残基不同导致其主产物不同；柠檬烯合酶催化 生成柠檬烯，将其关键位点进行突变后产物变为蒎烯或水芹烯。萜类合酶通过影响底物碳正离子的重排来形成不同的萜类骨架，不同的萜类合酶对底物构象的限制和防止碳正离子重排的机制不同，因而导致不同的萜类合酶在产物选择性上有所差异。碳正离子的重排通常与萜类合酶的芳香残基或极性侧链相关。在本研究中获得的 与前期鉴定功能的阳春砂蒎烯合酶 序列高度相似，经体外酶活实验证明该基因所编码的酶能够催化 产生蒎烯，但二者在产物的选择性偏好上有所不同，催化产生的单萜产物中蒎烯占比最高，为，而在 的单萜产物中，蒎烯为主要产物，占比。催化 生成的产物中 蒎 烯占.，可见其产物具有蒎烯高选择性，但将其芳香残基 突变为、后该酶转变成香桧烯合酶，其中 以上的蒎烯产物转变成香桧烯，可见此位点对于蒎烯的合成至关重要。由图 结果可见 与 在此位点均为，和其他蒎烯合酶的此位点为，而芳樟醇合酶 在此位点为，因此推测此位点（或）是蒎烯合酶催化生成蒎烯的关键氨基酸位点。此外，与 启动子区域含有较多与胁迫相关的调控元件，如 含有缺氧特异性诱导元件、脱落酸响应元件，含有赤霉素应答元件等，两者均含有较多的光响应元件和 个茉莉酸甲酯响应元件。因此，和 的表达可能受多种环境因素或激素的调控。本论文首次从药用植物阳春砂中鉴定了以蒎烯为主产物的萜类合酶，并分析了蒎烯合酶可能的关键氨基酸位点，为不同构型蒎烯的生物合成提供 年 月第 卷第 期.，.，新的基因元件。阳春砂 个蒎烯合酶催化生成不同蒎烯异构体的关键氨基酸位点有待进一步挖掘和验证。参考文献 ，（）：，（）：王宪东，秦雨东，戴翥 南药砂仁的研究进展 中国民族民间医药，