养殖尾水浮床处理系统水生植物根际细菌的氮循环作用机制_曲疆奇.pdf

第 38 卷第 1 期大 连 海 洋 大 学 学 报大 连 海 洋 大 学 学 报Vol.38 No.12 0 2 3 年 2 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYFeb.2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-131文章编号:2095-1388(2023)01-0012-10养殖尾水浮床处理系统水生植物根际细菌的氮循环作用机制曲疆奇1,刘青2,张清靖1,杨浩辰1,2,赵萌1,朱华1(1.北京市农林科学院水产科学研究所 渔业生物技术北京重点实验室,北京 100068;2.大连海洋大学 水产与生命学院,辽宁 大连 116023)摘要:为探讨养殖尾水处理中浮床水生植物根际细菌对水体氮循环的影响机制,采用 16S rRNA 基因扩增子测序和宏基因组测序技术方法,对浮床水生植物黄花鸢尾(Iris wilsonii C.H.Wright)根际细菌、水体细菌的群落结构及其与氮循环相关的功能基因丰度差异特征进行了研究。结果表明:生态浮床水生植物根际细菌以变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、Patescibacteria 门和拟杆菌门(Bacteroidota)为主要优势门类;在属水平上,有 10 种关键功能菌属在氮素迁移转化关键过程中发挥了重要作用;与水体相比,水生植物根际细菌多样性较高,氮代谢活动更为活跃(P0.05),且主要参与碳代谢、转运蛋白、细菌双组分调节系统和群体感应等代谢功能途径;根际细菌固氮功能基因(nifH、nifD 和 nifK)、硝化作用功能基因(hao)、反硝化作用功能基因(nirS、norB 和 nosZ)、异化/同化硝酸盐还原基因(napA、nrfA、nirB 和 nasA)及其 6 个氮循环关键酶的相对丰度均显著升高(P0.05)。研究表明,生态浮床水生植物根际的氮素周转能力强于周围水环境,其生物脱氮的最主要方式是反硝化和异化硝酸盐还原过程。关键词:水生植物;生态浮床;根际微生物;氮循环作用中图分类号:S 949 文献标志码:A 生态浮床技术是一项造价成本较为低廉、管理便捷且无能源消耗的环境友好型水质调控修复技术1,该技术被广泛应用于富营养化河湖水体和黑臭水体的生态修复和造景中2-3。水生植物是生态浮床最主要的组成成分之一。生态浮床可以利用水生植物根系主动吸收水体中的一部分氮、磷等营养物质以满足自身生长所需;同时,其根系在水中分散面积较大,可为微生物生长提供附着位点,并逐渐形成生物膜。水生植物根系分泌的氧气促使植物根系生物膜持续生长,并在胞外聚合物的作用下形成了“好氧-兼氧-缺氧”的微生物共生体环境,为水生植物根际氮循环过程和氮素转化提供了良好的场所,从而加速了大分子污染物的降解和转化,并达到水质净化的目的4。因此,深入了解浮床水生植物根际微生物群落结构及其功能对养殖池塘水质调控至关重要。中国是内陆水产养殖第一大国,渔业产业关系到民生和社会稳定,处理好养殖尾水环境污染问题是当前渔业发展面临的重要问题。实践证明,生态浮床是当前水产养殖生态沟渠、生态塘和潜流湿地等尾水处理设施升级改造的重要组成部分。目前,关于生态浮床的研究多集中在浮床水生植物的筛选5及生态浮床对水体污染物的吸收和净化效果6等方面,而对浮床水生植物的根际生态调控过程研究不够深入,缺乏浮床水生植物根际氮循环功能微生物群落生态特征与作用研究。宏基因组学为探究环境与微生物生态功能间的相互作用开辟了新的研究途径。宏基因组高通量测序技术在植物修复7、重金属生物修复8、污染区域有毒物质降解9和河流健康生态系统评估10等生态学研究方面显示出巨大的潜力,能够揭示生态系统中微生物群落的动态、功能潜力和生物地球化学过程。本研究中,以养殖尾水生态塘系统内浮床水生植物黄花鸢尾(Iris wilsonii C.H.Wright)根 收稿日期:2022-04-25 基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”项目(2020YFD0900103);北京市农林科学院青年科研基金(QNJJ202020);河北省重点研发计划(22326701D,19226703D);现代农业产业技术体系北京市渔业创新团队项目(BAIC07-2022-06)作者简介:曲疆奇(1985),男,副研究员。E-mail:quqi20122012 通信作者:张清靖(1974),男,研究员。E-mail:zhangqjhbs 际细菌为研究对象,通过宏基因组高通量测序技术分析植物根际细菌类群、多样性及氮循环功能基因富集特征,同时确定在养殖尾水脱氮处理中发挥关键作用的功能细菌类群,以期为养殖尾水浮床生态修复实践应用提供科学参考。1 材料与方法1.1 材料本试验于 2020 年在北京市农林科学院水产科学研究所示范基地养殖尾水生态浮床系统(长宽深为 60 m50 m2 m)中进行,所选池塘以大口黑鲈(Micropterus salmoides)为主要养殖鱼类,搭配少量花白鲢。生态浮床及黄花鸢尾均购自河北廊坊莲韵苑水环境景观有限公司。在生态塘中铺设总面积为 250 m2 的生态浮床,并在浮床上栽种黄花鸢尾(16 株/m2)(图 1)。待水生植物栽种生长稳定后,在养殖高峰期的 58 月进行试验。图 1 生态浮床养殖尾水处理系统Fig.1Ecological floating-bed systems for aquaculture tailwater treatment1.2 方法1.2.1 样本采集试验期间,每月分别在生态浮床的前、中、后部采集黄花鸢尾各 1 株,用灭菌剪刀截取水生植物根部装入无菌密封袋中;同时,在相同位点分别采集水生植物周围水体样本各500 mL。将上述样本装入冷藏箱中带回实验室进行前处理。参考陈嗣威等11的研究方法,从每组黄花鸢尾样本随机截取根部 10 g,用去离子无菌水冲洗后,置于装有 10 mL 浓度为 0.1 mol/L 的磷酸钾缓冲液(pH 8.0)离心管中振荡重复洗涤 2 次,然后将根部取出放入装有50 mL 磷酸盐缓冲液离心管中超声波洗涤 10 min,最后将 3 次洗涤液混合后用孔径为 0.22 m 的已灭菌水系微孔滤膜过滤,将滤膜折叠存放于冻存管中,于-80 超低温冰箱中保存,标记为水生植物根际细菌样本 R 组。水体样本经无菌滤纸除杂后,同样通过滤膜抽滤方式获取水体细菌样本,标记为 FW 组。试验期间,共采集 24 个样本用于 16S rRNA 高通量测序和宏基因组高通量测序分析。1.2.2 细菌16S rRNA 基因扩增子高通量测序分析使用 FastDNATM Spin Kit for Soil(MP Biomedicals 美国)提取根际和水体样本细菌 DNA,待所有样本 DNA 浓度和纯度检验合格后,用干冰保存寄送至上海美吉生物医药科技有限公司进行 16S rRNA基因扩增子高通量测序和宏基因组测序。以细菌特异性引物 338F 和 806R(338F:5ACTCCTACGG-GAGGCAGCAG 3,806R:5 GGACTACHVGGGT-WTCTAAT 3)扩增 16S rRNA 基因 V3 V4 高变区,构建测序文库后,基于 illumina Miseq PE300高通量测序技术对浮床水生植物根际细菌群落结构和多样性特征进行研究。1.2.3 宏基因组测序分析 将 DNA 片段化,筛选约 400 bp 的片段,利用 NEXT flexTM Rapid DNA-Seq(Bio Scientific)构建 PE 文库。采用 Hiseq Xten(Illumina)测序平台进行宏基因组测序,保证每个样本 要 达 到 6G 以 上 数 据。使 用 Fastp 0.20.0(https:/ 原 始 数据 reads 进行质量剪切,去除剪切后长度小于50 bp、平均碱基质量值低于 20 及含 N 碱基的reads,保留高质量的 pair-end reads 和 single-end reads,并对优化序列进行拼接组装。采用 Meta Gene(http:/metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)对拼接结果中的 contigs 进行开放阅读框 ORF 预测,利用 CD-HIT 4.6.1 在线软件(http:/www.bioin-formatics.org/cd-hit/)构建非冗余基因集。最后使用 SOAP Align 2.21 软件(http:/ reads 与非冗余基因集进行比对(95%identity),统计基因在对应样品中的丰度信息,对得到的基因进行 NR(amino acid sequence of non-redundant protein)物种注释和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)功能注释,筛选得到与氮循环代谢相关的基因类群及其相对丰度信息。1.2.4 多样性指数的计算 使用 Mothur 软件在同一分 类 单 元 OTUs 水 平 上 计 算 Shannon(H)、Simpson(D)和 Chao1(S)等 多样指数,并绘制细菌组成图。31第 1 期曲疆奇,等:养殖尾水浮床处理系统水生植物根际细菌的氮循环作用机制 H=-Sobsi=1(ni/N)ln(ni/N),(1)D=Sobsi=1ni(ni-1)/N(N-1),(2)S=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)。(3)其中:Sobs为实际观测到的 OTUs 数目;ni为第 i 个OTUs 所含的序列数;N 为所有序列数;n1为只含有一条序列的 OTU 数目;n2为只含有两条序列的OTU 数目。Shannon 指数和 Simpson 指数是估算样本中微生物多样性的重要指数,Shannon 值越大或Simpson 值越小,说明群落多样性越高;而 Chao1指数是用来衡量微生物群落丰富度的指数,指数越大,说明群落丰富度越高。1.3 数据处理使用 Excel 2007 软件和上海美吉生物云平台对试验数据进行处理和作图。采用 SPSS 20 软件对不同组间的 KEGG 代谢功能、氮循环功能基因和关键酶等进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用 T 检验进行组间差异分析,显著性水平设为0.05,极显著性水平设为 0.01 和 0.001。2 结果与分析2.1 细菌多样性及群落结构差异特征通过 16S rRNA 扩增子高通量测序共获得970 172 条有效 16S rRNA 基因序列,基于 97%一致性将序列划分为 2 631 个 OTUs。从表 1 可见,浮床植物根际组(R)的细菌群落 Shannon 指数和Chao1 指数均显著高于水体组(FW)(P0.05),说明浮床水生植物根际细菌多样性高,群落组成更为丰富。表 1 生态浮床植物根际及水体细菌 多样性指数特征Tab.1 Microbial alpha diversity index in plant rhizosphere and water in the ecological floating bed月份month组别group分类单元OTUs香农多样性指数Shannon index辛普森多样性指数Simpson indexChao1 指数Chao1 index5根际 R1 786.6792.95a6.410.17a0.010.00b2 012.58107.30a水体 FW594.67160.00b3.730.89b0.060.04a878.46177.07 b6根际 R2 006.33143.86a5.890.55a0.030.02a2 224.38110.12a水体 FW834.332.08b4.560.06b0.040.01a1 133.0634.04b7根际 R2 037.6770.71a6.350.23a0.010.00b2 248.6552.34a水体 FW1 690.6767.12b4.760.15b0.050.01a2 039.9330.52a8根