药用真菌桑黄抗氧化活性及化学成分分析_宋吉玲.pdf

药药用用真真菌菌桑桑黄黄抗抗氧氧化化活活性性及及化化学学成成分分分分析析宋吉玲，陈佳慧，王战伟，舒玉婷，李福森，崔婧，王晶（长春师范大学，吉林 长春）摘 要本文以野生桑黄为研究对象，以其醇提取物对三种自由基（，二苯基三硝基苯肼自由基 、超氧阴离子自由基 和羟基自由基 ）的清除率为指标，采用紫外分光光度法评价其体外 抗 氧 化 活 性，同 时 应 用 高 效 液 相 色 谱 质 谱 联 用 技 术（，）分析桑黄醇提物中主要化学成分。结果表明，桑黄醇提取物对三种自由基均具一定的清除能力，但对 、清除能力较好。并且应用 技术从桑黄醇提物中快速分离并鉴定了 种化合物，大部分化合物的骨架为苯乙烯基吡喃酮（），其中含量较高的成分分别为 、。本文的研究证实桑黄醇提取物具有潜在的体外抗氧化活性，为其相关药效物质进一步研究提供实验依据。关键词桑黄；高效液相色谱质谱联用；抗氧化活性；化学成分；苯乙烯基吡喃酮中图分类号 文献标志码 文章编号（）桑黄（）又名桑上寄生、桑臣等，隶属于担子菌亚门（）、伞菌纲（）、锈革菌目（），属多孔菌科木层孔菌属。主要生长于柳树、杨树、山楂树等树干或树桩上。桑黄为传统中药，具记载已有两千多年的历史，其名曾在唐初甄权所著药性论中出现，李时珍所著本草纲目中也有相关描述。多糖、黄酮、萜类、多酚为其主要活性成分，其中苯乙烯基吡喃酮和苯并吡喃酮是近年来在桑黄中发现的新骨架化合物。现代药理作用研究表明，桑黄具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、降尿酸等多种功效。目前，对于桑黄有效成分研究主要集中于多糖类化合物，药理活性研究聚焦于抗肿瘤等，而关于桑黄抗氧化活性及成分研究相对较少。研究表明，人体中含有大量的活性氧（，），而过量的 能通过氧化反应的形式引起器官功能退化及各种功能障碍，进一步导致中风、炎症、动脉粥样硬化和肝脏损伤疾病等多种疾病。清除这些过量的，利于机体延缓衰老，使机体的抗氧化水平达到平衡。目前关于氧化应激的药物大多为合成药物，其毒副作用大、药效低，而安全天然的抗氧化物质毒副作用小，药效高。因此，开发天然的菌类植物源抗氧化剂具有重要意义。该研究基于紫外分光光度法评价桑黄乙醇提取物对，二苯基三硝基苯肼自由基（）、超氧阴离子自由基（），羟基自由基（）清除能力，同时采用 技术快速分析鉴定醇提物中的主要化学成分，为桑黄的药效物质基础研究和开发利用提供参考。收稿日期基金项目长春师范大学研究生科研创新项目“桑黄中活性成分及抗痛风作用机制研究”（第 号）。作者简介宋吉玲，女，硕士研究生，从事天然药物分析化学研究。通信作者王晶，女，副教授，博士，从事天然药物分析化学研究。实验部分 试剂与仪器野生桑黄子实体购买于延边华厦有限公司（吉林）；，二苯基三硝基苯肼自由基购买于源叶生物科技有限公司（上海）；邻二氮菲、氯化氮蓝四唑（）、吩嗪硫酸甲酯（）及还原性辅酶（）均购买于阿拉丁化学公司（上海）；磷酸氢钠、过氧化氢、硫酸亚铁及乙醇购买于鼎国生物技术有限责任公司（北京）。液相色谱质谱联用仪（配备二极管阵列检测器，美国赛默飞世尔科技有限公司）；型多功能读板器（美国 公司）。实验步骤 样品制备准确称取研磨后干燥的桑黄子实体 ，置于 烧杯中，按料液比（）加入 乙醇溶液，浸泡过夜。然后采用超声法进行提取（，），抽滤，滤液在 条件下真空减压浓缩至干，用色谱甲醇（）进行溶解，得桑黄提取物溶液（），冰箱待用。羟基自由基清除能力评价羟基自由基清除能力实验在 孔板中进行，实验分为空白组、对照组以及样品组，在空白组中，总体积，包含邻二氮菲溶液（，）、溶液（，）、超纯水（）和磷酸盐缓冲溶液（，），充分混匀后加入 溶液（，）启动反应，在 条件下孵育 后，于 处测定其吸光度值，记为。对照组中，用超纯水代替 溶液，其他溶液及条件均不变，吸光值记为。样品组中，用不同浓度的桑黄提取物溶液代替超纯水，其他溶液及条件均不变，吸光值记为。按照下列公式计算溶液对 清除率。(）（）超氧阴离子清除能力评价 系统用于评估桑黄提取物的超氧阴离子清除能力，实验在 孔板中进行。离心管中反应混合物（最终体积为 ）包含 溶液（，）、溶液（，）以及不同浓度桑黄提取物溶液（），充分混匀后移取 加入 孔板中，条件下孵育 后，加入 溶液（，）启动反应，在 处测定吸光度值，记为。对照组用等体积的甲醇溶液代替，吸光值记为。按照下列公式计算溶液对 清除率。(）自由基清除能力评价实验在 孔板中进行，将不同浓度桑黄提取物（）与（，）溶液适当振动充分混合后，室温避光放置 ，于 处测定其吸光度值，记为，对照组记为，根据下列公式计算溶液对 的清除率。(）色谱分析条件分析条件：色谱柱为 （），醋酸水溶液（流动相），色谱甲醇（流动相）；线性梯度洗脱过程如下：（）；（）；（）；（）；（）；检测波长为 ，流速为 ，进样量为 。质谱分析条件分析条件：离子源，负离子扫描模式，扫描范围（）；毛细管温度，电压；透镜电压 ，鞘气压力 ，辅助气压力 。数据处理所有抗氧化评价实验重复 次，采用 软件对实验数据进行处理及分析。结果与讨论 桑黄提取物对 清除能力以 为生成系统，在作用下，还原生成不溶于水、蓝色的二甲替（），其最大吸收波长为 ，以 还原法测定 的生成情况，从而测定桑黄乙醇提取物的抗氧化能力。以甲醇将桑黄提取物稀释为、，作为横坐标，清除率为纵坐标进行作图，结果如图 所示，桑黄乙醇提取物对 的清除能力分别为、，随着样品浓度的增加，清除能力逐渐增大。结果表明，桑黄乙醇提取物具有良好的清除 的能力。图 桑黄提取物对 清除能力 图 桑黄提取物对 清除能力 桑黄提取物对 清除能力以 体系为生成系统，在反应体系中加入 清除剂，则反应产生的 将被全部或部分清除，同时邻二氮菲也会减少，吸光度就会发生变化。根据这一原理，可以通过吸光度值的变化来反映桑黄乙醇提取物对 清除作用。以甲醇将桑黄提取物稀释为、为横坐标，清除率为纵坐标进行作图。如图 所示，桑黄乙醇提取物对 的清除能力分别为、.、.。结果表明，桑黄乙醇提取物清除 的能力相对较弱。桑黄提取物对 清除能力，二苯基三硝基苯肼（）是一种稳定的自由基化合物，其醇溶液呈深紫色，在约 处有强吸收。当体系中存在抗氧化剂时，会被清除，溶液颜色变浅，其吸光度下降，在一定范围内吸光度的变化与自由基清除能力成正比，因此，可通过吸光度值的变化来评价样品对 清除作用。以甲醇将桑黄提取物稀释为、为横坐标，清除率为纵坐标进行作图。如图 所示，桑黄乙醇提取物对 的清除能力分别为、。结果表明，桑黄乙醇提取物具有良好的清除 的能力。图 桑黄提取物对 清除能力 法分析桑黄醇提物中化学成分在上述色谱和质谱条件下，采用 技术对桑黄乙醇提取物中活性成分进行分析和鉴定。依据质谱分子离子峰，同时查阅相关文献，从桑黄子实体提取物中初步推测了 种活性成分的类别。各化合物的色谱质谱信息如表 所示。种化合物中大部分是多酚化合物，主要是吡喃酮类化合物，此类物质结构主要由苯乙烯基吡喃酮 为骨架聚合。吡喃酮物质二级质谱主要产生 （）或（）和 （）的特征碎片离子。图 桑黄子实体醇提物 色谱图（）和总离子流图（）表 桑黄子实体醇提物 数据分析序号保留时间分子式相对分子质量测量值碎片离子推测化合物类别，（）（，）（）（，）（），桑黄素，桑黄黄酮，山柰素 讨论桑黄是一种珍贵的食药用真菌类，近年来也是其中的研究热点之一，目前对于其活性的研究主要集中于抗癌、抗肿瘤等方面，对其他方面的研究相对较少。本研究以桑黄子实体的乙醇提取物为研究对象，采用紫外分光光度法，以 孔板为评价反应体系的实验载体，实现高通量、快速、准确地评价其对三种不同自由基的清除能力，并采用 法分析鉴定该提取物中的主要化学成分。结果表明，桑黄子实体乙醇提取物具有较好的抗氧化活性，特别是对 和 的清除能力较好。此外，从醇提物中初步分析鉴定了 种化学成分，其大多数为多酚化合物，是苯乙烯基吡喃酮（）的衍生物。研究表明 对 、表现出显著的抗氧化活性，而含量较高的成分比如、又具有多个酚羟基，因此大部分具有较强的抗氧化作用。本文研究表明，桑黄醇提取物具有较好的体外抗氧化活性，并且方法重现性好、效率高，能减少溶剂的消耗，为桑黄的药效物质基础研究提供参考。参考文献吴声华，戴玉成药用真菌桑黄的种类解析菌物学报，（）：张志昌，杨慧，顾昌华，等“森林黄金”桑黄的多功能研究进展综述黑龙江粮食，（）：王旭，焦月华，郑秀茜，等桑黄化学成分及药理作用的研究进展化学工程师，（）：昝立峰，范宇光，包海鹰，等基于 技术分析野生与栽培杨树桑黄的化学成分天然产物研究与开发，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：王晶，时东方，黄琳，等微孔读板法快速评价桑黄提取物抗氧化活性中国食品添加剂，（）：曾霓四种黄酮类化合物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用及机制研究南昌：南昌大学，丁云云药用真菌桑黄化学成分的研究合肥：安徽医科大学，寿旦中药酮类活性成分提取和分析的色谱联用技术研究杭州：浙江大学，吴长生药用真菌桑黄化学成分的研究济南：山东大学，（，）：，（，），（），（），：；（责任编辑：王桂君）