羊传染性脓疱灭活疫苗的制备及临床免疫效果观察_李璋赟.pdf

2023年1月第1期（总第218期）草食家畜（双月刊）羊传染性脓疱灭活疫苗的制备及临床免疫效果观察李璋赟1，汪萍2，金映红2，薛晶2，汪阳3，陈古丽2，夏俊2*（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；2.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，乌鲁木齐830000；3.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐830000）摘要：为制备羊传染性脓疱灭活疫苗并评价其免疫效果，试验中制备羔羊睾丸原代细胞后增殖羊传染性脓疱病毒并运用切向流超滤膜对病毒液进行10倍浓缩，使用-丙内酯灭活的病毒液按1：1混合206佐剂制备羊传染性脓疱灭活疫苗，在常发羊传染性脓疱的羊场进行免疫试验并观察免疫效果。羔羊睾丸细胞在接种病毒后有明显细胞病变，经毒力检测病毒原液滴度为106.3TCID50/0.1 mL，10倍浓缩液滴度为107.5TCID50/0.1 mL，用制备的羊传染性脓疱灭活疫苗对孕羊及羔羊采用肌内注射的方式进行免疫，经观察灭活疫苗对羔羊有明显保护力。切向流超滤膜浓缩效果良好，对保留病毒粒子，提高病毒浓度效果显著；羊传染性脓疱灭活疫苗对常发病羊场羔羊保护效果显著。关键词：羊传染性脓疱；灭活疫苗；超滤浓缩中图分类号：S859文献标识码：A文章编号：10036377（2023）010028-07羊传染性脓疱（contagious ecthyma）俗称羊口疮（orf）、羊传染性脓疱皮炎（contagious pustular dermatitis，CPD），是由羊传染性脓疱病毒引起的人畜共患病。该病主要引起羔羊口唇等部位的皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡及疣状厚痂1。目前还没有商用疫苗能够完全预防羊传染性脓疱病毒感染。弱毒疫苗进行皮肤划痕免疫能够预防羊传染性脓疱病毒感染2，但存在免疫方法繁琐、保护期短的缺陷，在基层难以推广使用。使用灭活疫苗对产前孕羊进行免疫，羔羊可通过初乳获得抗体3产生对羊传染性脓疱的抵抗力。基金项目：新疆维吾尔自治区重大专项“肉牛高效健康饲养技术集成研究与示范”（2021A02003-1）；新疆维吾尔自治区动物疫情监测及防治项目“牛羊常见多发疫病防治技术指导及绵羊传染性胸膜肺炎诊断试剂盒推广应用”；新疆维吾尔自治区农区高效肉羊品种选育推广技术体系项目（xjnqry-g-2204）;中央引导地方科技发展专项资金项目“羊多联（多价）疫苗集成研发与应用”。作者简介：李璋赟(1996-)，女，在读硕士研究生。研究方向为动物传染病免疫学。E-mail：通讯作者：夏俊（1980-），男，研究员，主要从事牛羊传染病防控技术研究。E-mail：收稿日期：2022-11-19，修回日期：2023-11-3010.16863/ki.1003-6377.2023.01.005282023年1月第1期（总第218期）草食家畜（双月刊）1材料与方法1.1细胞与病毒羔羊睾丸细胞取自20日龄雄性羔羊睾丸；病毒为新疆畜牧科学院兽医研究所保存的羊传染性脓疱强毒株。1.2试剂与仪器超滤膜包Vivaflow R 50R及相关配件购自德国赛多利斯集团；-丙内酯生产自Solarbio集团；蠕动泵为Easy-load生产；MEM培养基、胎牛血清、胰酶和青霉素-链霉素溶液（青霉素10 000 units/mL，链霉素10 000 ug/mL）均购自HyClone公司；DNA提取试剂盒购自TIANGEN生物技术股份有限公司；PCR反应相关试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。1.3羔羊睾丸细胞的制备制备细胞前配置细胞生长液，500 mL MEM培养基中加入50 mL胎牛血清和10 mL青霉素-链霉素溶液，混匀置4 备用。无菌采集20日龄雄性羔羊睾丸，用无菌剪刀和镊子剥离睾丸外部组织，并用MEM冲洗23次；将清洗完毕的睾丸组织剪碎，称重，置入无菌锥形瓶内；按净重的4倍加入0.25%胰酶消化液，置4 冰箱消化12 h，待组织表面呈绒毛状，弃消化液，用玻璃珠振摇加入细胞生长液收集细胞悬液，细胞悬液用4层纱布过滤后1 000 rpm离心5 min，弃去上清液，用细胞培养液重悬细胞后将细胞悬液以适宜浓度培养于细胞培养瓶中，置37 培养23 d即获得羔羊睾丸原代细胞。1.4接种病毒接种病毒前需配置维持液，在500 mL MEM培养基中加入10 mL胎牛血清和10 mL青霉素-链霉素溶液，混匀置4 备用。取已生长至细胞瓶底70%的羔羊睾丸细胞，弃去培养液，用加入10 mL青霉素-链霉素溶液的MEM培养液清洗细胞23次。以5%的浓度接种羊传染性脓疱病毒，置37 培养箱吸附1 h，后加入维持液，约24 h出现明显细胞病变，当细胞病变达80%时收毒，于-20 室温反复冻融3次。1.5超滤膜包大小的选择及病毒液的浓缩超滤膜的选择原则是超滤膜的孔径要小于待浓缩蛋白分子直径，一般为目标蛋白分子直径的1/51/34，为减少传染性脓疱病毒分子损失，选择使用100 KD超滤膜。将大量培养的羊传染性脓疱病毒液用超滤膜进行10倍浓缩。将待浓缩病毒液离心后取上清液混匀，将膜包及进液管、出液管和滤出管安装完毕并与蠕动泵连接完全。打开蠕动泵，速度调整为200300 mL/min。将待测病毒液浓缩至10倍时，将进液管从待测浓缩病毒液中取出，超滤膜包内所有液体泵入收集杯内时，关闭蠕动泵，收集杯内病毒液即为浓缩完毕的10倍浓缩病毒液。1.6测定病毒毒力将正常羔羊睾丸细胞弃去培养液，加入少量胰酶清洗细胞23次，弃去液体后再加入胰酶溶液进行细胞消化，待培养瓶底部细胞由透明变为毛玻璃样时弃去胰酶，轻轻摇晃培养瓶，将羔羊睾丸细胞从培养瓶上摇下，加入少量细胞培养液终止胰酶反应，用移液器多次吹打细胞悬液，将细胞团块吹散。将细胞悬液加入到96孔板中，每孔加入细胞悬液100 L，轻轻摇晃96孔板，使细胞均匀分布于96孔板。置37，5CO2培养箱培养24 h。收获的病毒原液和10倍浓缩病毒液用维持液做10倍梯度稀释，取8个梯度各100 L加到96孔板内，同时设定只加入维持液100 L的孔作为阴性对照，加入100 L病毒原液的孔为阳性对照。置37，5CO2培养箱培养，观察细胞病变，并记录每个细胞病变孔出现的时间及稀释的浓292023年1月第1期（总第218期）草食家畜（双月刊）度，用Reed-Muench法计算病毒液TCID505。1.7制备传染性脓疱灭活疫苗1.7.110倍浓缩病毒液的灭活取浓缩后病毒液，按体积比为14 000比例加入-丙内酯灭活，4 作用24 h，每隔3 h颠倒摇动一次，24 h后病毒液置37 水浴2 h脱毒。取少量已灭活的羊口疮病毒液样品，接种于羔羊睾丸原代细胞和Vero细胞，观察羊睾丸原代细胞和Vero细胞是否发生病变来判断病毒液是否灭活完全。1.7.2灭活病毒液的乳化及相关检验取已灭活的病毒液与法国206佐剂以1:1的比例混合，使用磁力搅拌棒以300 r/min的速度将其搅拌均匀。稳定性检验，取10 mL已乳化的疫苗加到15 mL离心管中，3 000 r/min，15 min，若无分层则可保存一年。黏度检验，取内口直径为1.2 mm的吸管，在室温下吸满1 mL乳剂，垂直放出0.4 mL所需时间作为黏度单位，若流出时间为26 s即为合格。将已乳化好的疫苗以接种病毒的方式接种到羔羊睾丸细胞上，若无细胞病变即疫苗安全。1.8免疫程序免疫试验羊场为常发羊传染性脓疱羊场，未免疫羔羊在出生后1530 d自然条件下发病率100%。1.8.1孕羊免疫程序选取产前30 d体况良好的孕羊60只，分为A、B、C三组，每组孕羊20只，A组孕羊于产前28 d免疫一次，产前14 d免疫第二次，两次免疫均为3 mL/只。B组孕羊于产前28 d免疫一次，不进行二次免疫。C组为空白对照组，不进行免疫。1.8.2羔羊免疫程序A、B、C三组孕羊产出的羔羊均分为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3九组，A1、B1、C1组羔羊分别于出生1 d和14 d注射羊传染性脓疱灭活疫苗两次，均为肌内注射2 mL/只。A2、B2、C2组羔羊于出生1 d进行一次免疫，2 mL/只。C1、C2、C3组羔羊出生后不做处理。观察羔羊免疫后60 d内的发病情况并记录。2结果与分析2.1羔羊睾丸细胞制备的羔羊睾丸原代细胞24 h后有细胞贴壁，有明显圆形高透光悬浮细胞，部分细胞出芽明显。培养至48 h时细胞呈三角形。培养至72 h时细胞铺满T225细胞培养瓶底面，细胞界限清晰，细胞呈条索状，部分细胞可见明显漩涡状。见图1。注：A.培养24 h的羔羊睾丸细胞；B.培养48 h的羔羊睾丸细胞；C.培养72 h的羔羊睾丸细胞图1正常羔羊睾丸原代细胞302023年1月第1期（总第218期）草食家畜（双月刊）表210倍浓缩后的羊传染性脓疱病毒液TCID50测定结果稀释浓度细胞病变孔数累计细胞病变孔数无细胞病变孔数累计无细胞病变孔数累计细胞病变百分率10-551200100%（12/12）10-65700100%（7/7）10-7352271.4%（5/7）10-8223528.6%（2/7）10-9005100（0/10）稀释浓度细胞病变孔数累计细胞病变孔数无细胞病变孔数累计无细胞病变孔数累计细胞病变百分率10-451400100%（14/14）10-5491190%（9/10）10-6352362.5%（5/8）10-7223625%（2/8）10-8005110（0/11）2.2细胞病变结果羔羊睾丸原代细胞接种羊传染性脓疱病毒24 h后细胞边界模糊；48 h细胞核质颜色加深，细胞折光性增强，细胞间隙增大，细胞变圆，无明显漩涡状；72 h时细胞大量脱落，无明显细胞形态，细胞漩涡状完全消失不见，细胞聚集似葡萄。见图2。注：A.羔羊睾丸细胞接种病毒24 h；B.羔羊睾丸细胞接种病毒48 h；C.羔羊睾丸细胞接种病毒72 h图2接种羊传染性脓疱病毒的羔羊睾丸细胞2.3TCID50结果根据表1、表2统计，可计算出羊传染性脓疱病毒液TCID50效价为106.3TCID50/0.1 mL，10倍浓缩羊传染性脓疱病毒液TCID50效价为107.5TCID50/0.1 mL。表1羊传染性脓疱病毒液TCID50测定结果2.4制备灭活疫苗结果2.4.1病毒液的灭活结果10倍浓缩羊传染性脓疱病毒液灭活后接种羔羊睾丸细胞和Vero细胞并盲传三代，无细胞病变产生，312023年1月第1期（总第218期）草食家畜（双月刊）图5免疫组未发病羔羊图6未免疫组发病羔羊图3灭活病毒液接种羔羊睾丸细胞图4灭活病毒液接种Vero细胞组别母羊产前免疫次数羔羊出生后免疫次数羔羊发病率%（i/n）A12217%（2/12）A2210（0/14）A32021%（3/14）B11221%（3/14）B21136%（5/14）B31067%（8/12）C10229%（4/14）C20143%（6/14）C300100%（12/12）证明病毒液灭活、脱毒完全。见图3、图4。2.4.2灭活疫苗的乳化乳化后疫苗经检测均为合格。2.5动物免疫试验结果依据免疫程序进行灭活疫苗免疫后，对自然感染状态下的免疫组羔羊和对照组羔羊的发病率及发病情况进行统计，统计结果见表3。免疫组羔羊口唇部未见脓疱、痂皮等典型病变，如图5。发病羔羊口唇部有痂皮产生，口腔内有溃疡，如图6。试验结果证明本次制备的传染性脓疱灭活疫苗在正确免疫程序下能对羔羊产生保护力。表3羔羊发病情况322023年1月第1期（总第218期）草食家畜（双月刊）3讨论超滤技术是以特制超滤膜质材料为分离介质，利用滤膜的筛分性能。以超滤膜两侧压差作为推动力，在把提取液从滤膜高压一侧推至低压一侧过程中，将直径大于滤膜孔径的分子截流在高压一侧，从而克服了滤膜经常被堵塞的问题。本实验中对浓缩前后病毒液TCID50的检测可证明超滤膜浓缩对提高病毒效价效果明显。本实验中采了14 000-丙内酯作为灭活剂进行灭活，-丙内酯作为灭活剂可以直接作用于病毒核酸，而不作用于壳蛋白，不会破坏病毒的免疫原性；而且-丙内酯极易水解，37 作用2 h即可水解为无毒性的代谢产物