在黑果腺肋花楸中共发酵里氏木霉和绿色木霉生产木聚糖酶_袁亚峰.pdf

食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES602023 Vol.49 No.5(Total 473)DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 030403引用格式:袁亚峰，姜秋实，程志强 在黑果腺肋花楸中共发酵里氏木霉和绿色木霉生产木聚糖酶 J 食品与发酵工业，2023，49(5):60 66 YUAN Yafeng，JIANG Qiushi，CHENG Zhiqiang Production of xylanase from Trichoderma reesei and Trichoder-ma viride co-fermentation in Aronia melanocarpa J Food and Fermentation Industries，2023，49(5):60 66在黑果腺肋花楸中共发酵里氏木霉和绿色木霉生产木聚糖酶袁亚峰，姜秋实，程志强*(吉林农业大学 资源与环境学院，吉林 长春，130118)摘要木聚糖酶在造纸、酿酒等方面有广泛的应用。为了获得低成本高活力的木聚糖酶，以黑果腺肋花楸作为主要培养基原料，通过单因素试验和正交试验，探索里氏木霉和绿色木霉共发酵生产木聚糖酶的培养条件。结果表明，木聚糖酶活性最高的培养条件为氮源(NH4NO3)质量浓度 0 5 g/L，果渣质量分数 25%，里氏木霉与绿色木霉的质量比 3 2，接种质量分数 14%，pH 5 50，培养到第 4 天时，其木聚糖酶活性高达121 62 U/mL。同时还探究了无机离子添加量对木聚糖酶活性的影响，无机离子的最佳添加量是 MgSO412 mg/L 和 MnSO414 mg/L。结合正交试验的最佳培养条件以及最佳无机离子添加量进行发酵后，木聚糖酶的活性高达(12725 009)U/mL，与基础培养基相比，木聚糖酶产量增加了 69 46%。使用里氏木霉和绿色木霉共发酵黑果腺肋花楸生产木聚糖酶在获得了高活性木聚糖酶的同时降低了成本，对木聚糖酶工业化生产有重要参考价值。关键词黑果腺肋花楸;绿色木霉;里氏木霉;木聚糖酶;共发酵第一作者:硕士研究生(程志强教授为通信作者，E-mail:czq5974163 com)基金项目:吉林省科技厅科技发展计划重点研发项目(20200403166SF);吉林省科技厅科技发展计划项目医药健康专项(20200708066YY)收稿日期:2021-12-15，改回日期:2022-01-13木聚糖酶能够降解木聚糖，在造纸1、木质纤维材料生物转化以及果汁澄清2 等方面有着广泛的应用。目前研究表明，除了动物和植物，许多细菌和真菌都可以产生木聚糖酶，但是不同微生物生产的木聚糖酶性质有所差别，细菌生产的主要是酸性木聚糖酶3，真菌生产的大都是碱性木聚糖酶4。微生物发酵生产木聚糖酶具有经济性好，对生产设备、场地要求简单等诸多优势，因而是目前规模化生产木聚糖的主要方法。木霉菌是能产生多种酶类的丝状真菌，其中最主要的是木聚糖酶5 和纤维素酶6 等。国内外对木霉菌发酵产生木聚糖酶的研究较多。里氏木霉和绿色木霉生长周期短，产木聚糖酶的时间短，对环境要求低，是规模化生产木聚糖酶的理想真菌。但是单一菌株生产木聚糖酶存在产酶时间长、酶系组成单一、产酶量低等问题。利用混合发酵可以有效地解决上述问题并提高酶的活力。GUTIEEZ-COEA 等7 利用里氏木霉与黑曲霉或海枣曲霉共培养，在甘蔗渣上进行固体基质发酵生产木聚糖酶。邹水洋等8 发现较单独培养康宁木霉相比，康宁木霉与米根霉混合培养形成了相互促进的共生关系，有效地提高了纤维素酶和木聚糖酶的酶活力。BALDIAN9 将哈茨木霉添加到白腐菌培养物中使漆酶活性增加 40 倍以上。但是真菌共发酵生产酶仍然面临许多挑战和尚未解决的问题，特别是真菌之间的分子相互作用以及由此产生的酶优化问题。但是目前共培养仍然是工业酶生产的一个发展领域，在实际应用之前，该技术的培养方面需要进一步改进。木聚糖酶是一种诱导酶，选择适合的培养基和培养条件会促进木霉菌产木聚糖酶。目前，为了降低木聚糖酶的生产成本，一般都是利用秸秆10、麸皮、玉米芯、稻草11 等农业废弃物作为主要基质，里氏木霉12、绿色木霉、哈茨木霉13 等真菌进行发酵，多为固态发酵技术。由于固体发酵存在参数难控制，无法均匀混合，造成部分营养物质的浪费、回收成本高等问题，导致难以工业化生产木聚糖酶。农业废弃物作为原料，使用易于大量生产的液体发酵技术生产木聚糖酶的产量低10。为了提高农业废弃物生产木聚糖酶的产量，大都需要使用酸、碱等物质进行预处理，在提高木聚糖酶的产量的同时，预处理步骤提高了生产的成本，造成环境污染14。而以果渣作为碳源，使用液体发酵技术生产木聚糖酶产量高4，同时还利用了废弃果渣，避免了资源的浪费。黑果腺肋花楸在东北地区生长范围广，产量高，主要在工业上加工成果汁15，产生大量果渣。果渣质量分数占未加工生浆果的 16%，其中纤维含量约为 60 g/100 g，这些纤维研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)61大多是不溶性纤维，无法得到合理利用16。综上可知，黑果腺肋花楸果渣作为木霉菌发酵的碳源用于生产木聚糖酶是合理利用黑果腺肋花楸的有效途径。本文在液体深层发酵条件下，以废弃的黑果腺肋花楸果渣作为基础培养基，利用黑果腺肋花楸果渣丰富的纤维素和木质素作为碳源，诱导里氏木霉和绿色木霉共发酵产木聚糖酶，并通过正交试验对基础培养基进行优化，促进木霉菌低成本发酵生产木聚糖酶，为工业化生产木聚糖酶提供有效的参考价值。1材料与方法1 1材料、试剂与培养基1 1 1菌种里氏木霉(ATCC 24449)，瑞楚生物科技有限公司微生物菌种保藏中心;绿色木霉(ACCC 30206)，中国农业微生物菌种保藏管理中心;马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)，上海博微生物科技有限公司。将绿色木霉和里氏木霉经过活化后分别接种PDA 上，在 28 下培养 3 d。用无菌水分别将 PDA上的孢子冲洗下来后，得到里氏木霉孢子液和绿色木霉孢子液，分别使用血球计数法计数后，稀释到 106CFU/mL，并于 4 储存，备用。1 1 2试剂1 00%(质量分数)木聚糖溶液按照冯培勇等17 的方法配制;DNS 试剂参考 MILLE 等18 的方法配制。1 1 3基础培养基黑果腺肋花楸(长白山)的果实经采摘后烘干，打粉，并过 50 目筛，得到黑果腺肋花楸果渣(后称果渣)，储存备用。果渣质量分数为 25%，pH 值自然(pH 3 56)，置于锥形瓶中，121 灭菌 30 min。10%(质量分数)绿色木霉和里氏木霉孢子混合液(1 106CFU/mL，里氏木霉与绿色木霉按 1 1混合)接 入 已 灭 菌 的 培 养 基，28 空 气 浴 摇 床(160 r/min)培养 1 d。1 1 4粗酶液的制备通过液体深层发酵后，将培养基使用 4 层纱布初步过滤后，使用 20 mL 柠檬酸缓冲溶液冲洗后，得到的液体使用魏瑛等19 的方法制备粗酶液。1 2测试方法通过 BAILEY 等20 的方法测定培养基中木聚糖酶的活性。将 1 5 mL 1 00%木聚糖溶液置于 50 水浴锅中预热2 min，吸取0 5 mL 使用柠檬酸缓冲溶液稀释后的粗酶液加入木聚糖溶液中，立即计时，准确反应 30 min 后，迅速加入 3 mL DNS 试剂终止反应。然后在沸水浴中显色 5 min，取出后用去离子水定容到 50 mL，摇匀，冷却，于 550 nm 测定吸光度值。空白对照:先向木聚糖溶液中加入 DNS 试剂，置于沸水浴中，随后加入稀释酶液，按上述方法测定。1 3不同培养条件对木聚糖酶产量的影响在 1 1 3 所述基础培养基的条件下，通过单因素试验分别探究氮源、接种质量分数、里氏木霉和绿色木霉的质量比例、果渣质量分数、培养时间、培养基初始 pH 对木聚糖酶产量的影响。氮源包括赖氨酸、精氨酸、NaNO3、胰蛋白胨、NH4NO3、尿素、酵母提取物。绿色木霉接种质量分数设定为 6%16%，接种质量比例(里氏木霉与绿色木霉的质量比例)设定为 5 0，4 1，3 2，2 3，1 4，0 5，果渣的质量分数为 14%24%，培养时间设定为 1 7 d，酸碱度设定为 4 00 6 50。1 4正交优化里氏木霉和绿色木霉共发酵的培养基根据单因素试验结果，NH4NO3是里氏木霉和绿色木霉共发酵的培养基的最佳氮源;最佳培养时间为3 d;里氏木霉与绿色木霉的最佳质量比例为 3 2。对氮源质量浓度、果渣质量分数、接种质量分数、pH 4个培养条件进行四因素三水平 L9(34)正交试验，并测定木聚糖酶的活性，以确定不同条件相互组合的效果，并确定里氏木霉和绿色木霉共发酵的最佳培养基，因素水平见表 1。表 1培养条件正交试验因素水平Table 1Orthogonal experiment factor level ofculture conditions水平因素A(氮源质量浓度)/(gL1)B(果渣质量分数)/%C(接种质量分数)/%D(pH)10 325105 0020 430125 5030 535146 001 5无机离子对木聚糖酶产量的影响为测定无机离子对木聚糖酶活性的影响，分别将MgSO4(0、3、6、9、12、15、18、21 mg/L)、FeSO4(0、3、6、9、12、15、18、21 mg/L)、MnSO4(1、1 4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4 mg/L)、ZnCl2(0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 mg/L)、CoCl2(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/L)添加到培养基中，里氏木霉和绿色木霉共发酵后测定培养基中木聚糖酶活性，探究无机离食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATION INDUSTIES622023 Vol.49 No.5(Total 473)子对木聚糖酶产量的影响。1 6统计分析数据采用单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)进行评估，图中不同字母表示显著差异(P 0 001)。每组实验 3 个重复。2结果与讨论2 1氮源种类对木聚糖酶活性的影响氮源用于构成菌体细胞物质，木聚糖酶的合成受氮源种类和性质的影响非常大。本研究为了选取最适合木霉菌产木聚糖酶的氮源，在培养基中添加相同氮浓度的氮源。由图 1-a 可知，较未添加氮源的培养基相比，添加赖氨酸、精氨酸、NaNO3、胰蛋白胨、NH4NO3、尿素、酵母提取物 7 种氮源到培养基培养6 d 后，木聚糖酶的活性显著增加(P 0 001)。添加酵母提取物、蛋白胨、NH4NO3后，培养基中木聚糖酶的活性最高，分别为 83 30、83 35、84 19 U/mL。考虑到培养基的成本及木聚糖酶的产量，选择 NH4NO3作为发酵的氮源。2 2培养时间对木聚糖酶活性的影响两菌共发酵时，培养时间通常会对发酵结果造成一定的影响。图 1-b 反映了接入里氏木霉与绿色木霉后一周内粗酶液中木聚糖酶的活性变化情况。随着时间的增加，木聚糖酶的活性呈现先增加然后趋于平缓的趋势。发酵 4 d 及以后，随着时间的增加，木聚糖酶活性增加的不明显。所以，接种后培养 4 d 为里氏木霉与绿色木霉共发酵生产木聚糖酶的最佳培养时间，木聚糖酶活性为 83 14 U/mL。2 3接种质量比例对木聚糖酶活性的影响适合的接种质量比例有助于在共发酵培养基中促进里氏木霉和绿色木霉达到最佳共生状态，促进木聚糖酶的产生。如图 1-c 所示，里氏木霉和绿色木霉按照不同质量比接种后，发酵样品中木聚糖酶的活性显著变化(P 0 001)。当里氏木霉和绿色木霉接种质量比为 3 2时，溶液中木聚糖酶的活性最高，为85.36 U/mL。接种质量比例为 5 0，即只接种里氏木霉时，木聚糖酶活性为82 25 U/mL。而接种质量比例为 4 1时，培养基中里氏木霉在发酵初期吸收营养及繁殖的能力强于绿色木霉，会迅速成为优势菌种，进一步