张家口市鸡柔嫩艾美耳球虫对磺胺氯吡嗪钠的耐药性_关琛.pdf

762023年 第53卷 第2期鸡球虫病是一种寄生于鸡肠道上皮细胞的原虫病，主要危害3月龄以内的雏鸡，1040日龄时发病最为严重，发病率为50%70%，发病较为严重时高达80%，死亡率达20%30%1。研究表明，我国平均肉鸡养殖量为30亿60亿羽，平均每羽耗用抗球虫药费0.20.3元，每年抗球虫费用高达6亿18亿元2。如今养鸡产业主要以集约化和规模化的方式发展，使得鸡收稿日期：2022-11-16基金项目：河北省重点研发计划项目“全基因组关联分析研究柔嫩艾美尔球虫抗药性及PCR监测抗药性方法的建立”（19226610D）。作者简介：关琛，硕士，助理畜牧师，主要从事动物寄生虫病研究、畜牧技术推广和农业文化遗产保护工作。E-mail：通信作者：方素芳，博士，副教授，主要从事临床兽医学研究。E-mail：球虫病给养鸡产业带来的危害和经济损失也变得越来越大3。目前，鸡球虫病主要通过药物进行预防和治疗4，但由于市面上抗球虫药物各不相同，使得药物出现滥用现象，导致鸡球虫的抗药性问题变得日益严重。因此研究鸡球虫对某种药物的耐药程度，能有效缓解因球虫耐药性引发的诸多问题5。随着抗球虫药物的滥用，鸡球虫耐药株也张家口市鸡柔嫩艾美耳球虫对磺胺氯吡嗪钠的耐药性关琛1，王琼2，方素芳3*，王鹏3，顾小龙3，郭兵3，张丽云3，崔平3（1.张家口市畜牧技术推广站，河北张家口075000；2.张家口市动物疫病预防控制中心，河北张家口075000；3.河北北方学院动物科技学院，河北张家口075000）摘要：为了解张家口市鸡柔嫩艾美耳球虫耐磺胺氯吡嗪钠的情况，试验选取张家口市坝下地区蔚县、宣化区和坝上地区张北县、沽源县以磺胺氯吡嗪钠作为抗球虫药的养鸡场进行球虫耐药性检测。从采集的粪便样本中进行卵囊分离，宣化区和张北县粪便样本中检出球虫卵囊，蔚县和沽源县未检出卵囊。将检出卵囊的粪便样本进行卵囊分离保存，经耐药性试验发现，宣化地区柔嫩艾美耳球虫株对磺胺氯吡嗪钠的敏感浓度为9.6mg/kg，张北县为4.8mg/kg。本次试验结果可为张家口市养鸡场防治鸡柔嫩艾美耳球虫的给药浓度提供一定数据支持，有效缓解因球虫耐药性对养鸡产业造成的危害及经济损失。关键词：鸡柔嫩艾美耳球虫；磺胺氯吡嗪钠；耐药性；张家口中图分类号：S831.7文献标识码：A文章编号：1006-799X（2023）02-076-05试验研究DOI:10.15979/62-1064/s.2023.02.0282023年 第53卷 第2期77越来越多。研究发现，部分地区的球虫对市面上的抗球虫药如磺胺喹噁啉、尼卡巴嗪等都已具有完全抗药性，使得这些抗球虫药物基本丧失防治效果6。如安徽部分地区的柔嫩艾美耳球虫对磺胺喹噁啉、磺胺氯吡嗪钠和托曲珠利均存在不同程度的抗药性7；在对河南省和湖北省137个养鸡场中收集的318份新鲜粪便样本的磺胺氯吡嗪钠耐药性检测中发现，有25株对磺胺氯吡嗪钠完全耐药8。磺胺氯吡嗪钠性状为白色或淡黄色粉末，易溶于水，为磺胺类抗球虫药物9。药物内服后在消化道迅速吸收，34 h血药浓度达到峰值，并迅速经尿排泄，一个疗程为3d10，在鸡球虫病防治过程中，药物耐药性普遍存在。本试验通过研究张家口市部分地区的鸡柔嫩艾美耳球虫对磺胺氯吡嗪钠的耐药情况、摸清该地区鸡柔嫩艾美耳球虫虫株对药物的耐药浓度，为该地区鸡球虫病的防治提供重要的数据支撑，有效控制鸡球虫病的发病规模。试验材料1.1试验动物及虫株试验动物均为2周龄罗斯308肉雏鸡，共计350只，雌雄各半，体重一致，已进行常规免疫，在严格消毒和隔离的同一环境中饲养，严防球虫污染。试验所选用虫株是从蔚县、宣化区、张北县、沽源县4个县（区）中以磺胺氯吡嗪钠作为抗球虫药物的养鸡场中收集的，虫株收集方式为取新鲜鸡粪便中的卵囊。1.2试验试剂饱和食盐水、2.5%重铬酸钾溶液、生理盐水、磺胺氯吡嗪钠可溶粉（规格30%，河南惠农联科动物药业有限公司）。1.3试验仪器60目筛网、160目筛网、离心机（北京冠普佳能科技有限公司）、托盘天平、震荡摇床、显微镜（北京京昊永成商贸有限公司）、麦克马斯特计数板（海德创业生物科技有限公司）、恒温培养箱（宁波江南仪器厂）、玻璃棒、烧杯、手动计数器、载玻片、盖玻片、胶头滴管、培养皿。试验方法2.1耐磺胺氯吡嗪钠的调查采样与检测试验从张家口4个县（区）以磺胺氯吡嗪钠作为抗球虫药物的养鸡场中采集新鲜粪便进行卵囊检测。每个地区采集80份新鲜粪便，将采取好的粪便进行分装保存，标记采集地点、年龄、品种，带回实验室进行卵囊检查试验。2.2卵囊分离培养与保存球虫卵囊分离：取一定量的鸡新鲜粪便置于烧杯中，加入饱和食盐水（水量以刚好盖住样本为宜），搅拌均匀后将粪便匀浆过筛2次，分别为60目和160目；滤液进行3 000 r/min离心后，去除上清液；加入大约10倍沉淀物体积的饱和食盐水和沉淀物充分搅拌混匀，再次以3 000r/min的速度离心10min，用新试管收集上层漂浮的卵囊；收集稀释（按110的比例用水进行稀释）后，3 000 r/min离心洗涤，反复3次，去除上清液，所得沉淀即为球虫卵囊。球虫卵囊培养及保存：加重铬酸钾溶液使卵囊浓度达到1106个/mL，于28摇床内震荡培养4872h使卵囊孢子化；在培养期间进行镜检，孢子化率达到80%90%即可停止培养，置于4冰箱内保存备用。2.3卵囊复壮及增殖将4冰箱中保存的卵囊取出进行复壮，经口感染给2周龄雏鸡，每只鸡接种约5.0103个卵囊，当有大量卵囊排出时收集新鲜粪便进行分离培养。2.4分组给药与耐药浓度检测经球虫卵囊检测，仅在宣化区和张北县采集的粪便中发现球虫卵囊，蔚县与沽源县采集的粪便中未检出球虫卵囊，故后续试验只对宣化区和张北县开展。将试验用的2周龄雏鸡分为7组，每组50只，分别饲喂不同浓度的磺胺氯吡嗪钠（表1）。给药方式为混饮饲喂，于每日早晨9点进行给药，每天1次，连续3d；对照组正常饲喂和饮水，不进行给药。试验研究782023年 第53卷 第2期卵囊值=感染给药鸡卵囊百万数/感染不给药对照组卵囊数的百万数100%（3）病变值=各试验组平均病变记分100%（4）ACI（抗球虫指数）=（增重率+存活率）-（病变值+卵囊值）（5）其中，卵囊值判定标准详见表3，病变计分标准详见表4。判断标准病变分值肠壁厚度正常，内容物性质正常0分肠粘膜有点状出血，内容物性质正常1分肠内容物为粘液并出现少量血丝，肠壁略微增厚，肠粘膜有散在出血点2分肠内内容物出现灰白色奶酪样，肠壁肥厚，盲肠变形3分肠壁极度增厚，内容物呈奶酪样变化，粘膜布满出血点，粘膜部分脱落4分表4盲肠病变计分判定标准结果与分析3.1不同地区虫株对磺胺氯吡嗪钠的耐药性调查结果显示，蔚县和沽源县粪便样本中未检出球虫卵囊，宣化区和张北县粪便样本中检出球虫卵囊，表明蔚县地理株和沽源地理株对磺胺氯吡嗪钠敏感，未产生耐药性，而宣化区地理株和张北县地理株对磺胺氯吡嗪钠不敏感，具有耐药性（表5）。3.2不同地区虫株对磺胺氯吡嗪钠的耐药浓度通过检测宣化区和张北县球虫虫株对磺胺氯吡嗪钠的耐药程度，发现不同地区的虫株耐药情况不同。试验结果（表6）显示：对照组（CK）正常饲喂，发现其食欲正常、未出现死亡情况，增重率达95%，存活率为100%，2.5卵囊接种分组给药后的2周龄雏鸡经口感染复壮增殖后的球虫卵囊（A组接种宣化区分离的虫株，B组接种张北县分离的虫株），每只鸡感染5103个卵囊，对照组不进行感染。2.6耐药性检测判定指标和标准2.6.1粪便计分判定标准球虫粪便计分判定标准如表2。病变分值粪便情况0分正常1分少量血便2分中等量血便3分许多血便4分无正常粪便表2球虫粪便计分判定标准粪便匀浆中卵囊值占空白对照组的比例（%）卵囊值0.1012512650105175207610040表3卵囊值判定标准2.6.2ACI(抗球虫指数)测定计算公式如下：增重率=试验组增重量/对照组增重量100%（1）存活率=试验结束时存活鸡只数/试验组鸡总只数100%（2）试验研究表1试验分组及给药浓度分组情况给药浓度（mg/kg）对照组（CK）0宣化区组（A）A12.4A24.8A39.6张北县组（B）B12.4B24.8B39.62023年 第53卷 第2期79采样地区每克粪便卵囊计数（OPG）结果蔚县0阴性（-）宣化区0阴性（-）张北县8.0103阳性（+）沽源县3.0103阳性（+）表5不同地区虫株对磺胺氯吡嗪钠的耐药性表6不同地区虫株对磺胺氯吡嗪钠的耐药浓度组别试验动物（只）增重率（%）存活率（%）卵囊值病变记分ACI值耐药浓度（mg/kg）对照组（CK）5095100001952.4宣化区（A3）5085100001859.6张北县（B2）5083100001834.8试验研究卵囊值和病变计分均为0，ACI值为195，说明参试雏鸡无球虫病感染（若感染球虫病，则球虫对磺胺氯吡嗪钠的敏感浓度为2.4mg/kg），且未感染球虫病时饲喂磺胺氯吡嗪钠对雏鸡无影响。宣化区A1组试验雏鸡表现为精神沉郁、食欲减退，其新鲜粪便中检出球虫卵囊，血便计分为3；处死发病雏鸡收取全部肠道进行肠道解剖发现其盲肠病变且病变计分为3，由此可判断宣化区分离虫株对磺胺氯吡嗪钠的耐药性浓度高于2.4mg/kg。将磺胺氯吡嗪钠药物浓度增至4.8mg/kg（A2组），发现雏鸡精神沉郁程度有所减轻、食欲有所增加，但仍能从新鲜粪便中检出卵囊，血便计分为2；处死发病雏鸡进行肠道解剖，发现其盲肠病变且病变计分为2，说明虫株对浓度为4.8mg/kg的磺胺氯吡嗪钠依旧有耐药性。继续增加磺胺氯吡嗪钠药物浓度至9.6mg/kg（A3组），发现雏鸡精神正常、食欲正常、未出现死亡，增重率达85%、存活率为100%、病变记分为0、粪便中卵囊值为0、ACI（抗球虫指数）值为185，因此可确定宣化县分离的球虫虫株对磺胺氯吡嗪钠的敏感浓度为9.6mg/kg（表6）。张北县B1组试验雏鸡表现为精神沉郁、食欲不振且粪便中检出少量卵囊，血便计分为1，由此判断张北县分离虫株对浓度为2.4mg/kg的磺胺氯吡嗪钠具有耐药性。增加磺胺氯吡嗪钠药物浓度至4.8 mg/kg（B2组），发现鸡的精神正常、食欲增加、未出现死亡，增重率为83%、存活率为100%、卵囊值为0、病变记分为0、ACI值为183，说明张北县分离虫株对浓度为4.8 mg/kg的磺胺氯吡嗪钠药物敏感（表6）。因此，B3组即可停止试验。分析与讨论试验结果表明，张家口4个地区的球虫虫株对磺胺氯吡嗪钠药物的耐药情况不同，其中宣化区和张北县出现球虫耐药情况。通过查阅文献了解到安徽省、河南省和湖北省部分地区也存在对磺胺氯吡嗪钠药物的耐药情况，分析耐药原因，可能与地区用药区别有关，药物的不合理应用使球虫对磺胺氯吡嗪钠的药物耐药性普遍存在。本次试验所选用药物为磺胺氯吡嗪钠可溶粉，起始浓度为2.4mg/kg，为正常治疗量。若虫株对此药物浓度有耐药性，需在此浓度基础上进行翻倍给药；若虫株对药物敏感，则当前浓度即为耐药浓度。虫株耐药浓度结果表明，张家口4个地区不同虫株对磺胺氯吡嗪钠药物802023年 第53卷 第2期参考文献1沈克姑,田淑琴.鸡球虫抗药性问题的解决措施J.养禽与禽病防治,2008(9):36-38.2马立农,陈杖榴.鸡球虫耐药性的产生及其延缓措施J.湖北农学院学报,1999(2):3-5.3张新宇.和缓艾美耳球虫与早熟艾美耳球虫江苏株的分离鉴定及其生物学特性研究D.南京:南京农业大学,2011.4常晓辉,薛飞群,张丽芳.鸡球虫病药物防治的研究现状J.中国动物传染病学报,2011,19(5):71-75.5雷振宇.华中地区鸡球虫的分离鉴定及对磺胺氯吡嗪钠的抗药性分析D.武汉:华中农业大学,2018.6刘颖.柳州市区域性鸡球虫抗药性检测J.黑龙江畜牧兽医,2018(24):106-108.7肖寒,李培英,汪兴生,等.安徽部分地区鸡球虫对六种药物的抗药性研究J.安徽科技学院学报,2008(1):5-8.8耿天天,雷振宇,叶成,等.河南省湖北省鸡球虫的分离鉴定及其对磺胺氯吡嗪钠的抗药性分析A.中国畜牧兽