湛江地区患病对虾池塘中副溶...型和新型耐药毒株的分离鉴定_吴俊敏.pdf

第 38 卷第 1 期大 连 海 洋 大 学 学 报大 连 海 洋 大 学 学 报Vol.38 No.12 0 2 3 年 2 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYFeb.2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-056文章编号:2095-1388(2023)01-0059-09湛江地区患病对虾池塘中副溶血性弧菌的 MLST分型和新型耐药毒株的分离鉴定吴俊敏1,2,王艺2,郝婧薇2,王青瑶1,3,张晋1,2,傅松哲1,2,刘鹰1,4(1.设施渔业教育部重点实验室(大连海洋大学),辽宁 大连 116023;2.大连海洋大学 海洋科技与环境学院,辽宁 大连 116023;3.大连海洋大学 水产与生命学院,辽宁 大连 116023;4.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院,浙江 杭州 310058)摘要:为研究湛江地区患病对虾养殖池塘中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的遗传多样性,选择副溶血性弧菌的 7 个管家基因对分离菌株进行 MLST 分型,采用 PCR 法检测 tdh、trh、tlh、mam7、vcrD1、vcrD2 和 pirAB 毒力基因的携带情况,用纸片扩散法对所有菌株进行药敏试验,选择其中 1 株多重耐药菌株进行全基因组测序,并通过 IslandPath-DIOMB 分析其耐药基因岛来源。结果表明:从患病的对虾池塘水样中共分离出 58 株副溶血性弧菌,通过 MLST 分型共分为 34 个 ST 型;58 株菌株均携带毒力基因 tlh、mam7和 vcrD1,未发现 tdh、trh 和 vcrD2 基因存在,其中,8 株菌株携带引起急性肝胰腺坏死病(AHPND)的毒力基因 pirAB;药敏试验显示,58 株菌株对青霉素耐药率均为 100%,对氨苄西林、克拉霉素和庆大霉素的耐药率较高,其中 ST1740 型的 4 株菌株均为多重耐药,从中选择 ZJ20-3/2020 菌株进行全基因组测序,发现该菌株含有 8 个耐药基因,分别为 blaCARB-41、aadA16、aph(6)-Id、aph(3)-Ib、tet(A)、sul1、dfrA27 和ARR-3,并对青霉素、卡那霉素、四环素和利福平耐药;用 IslandPath-DIOMB 分析发现,ZJ20-3/2020 菌株存在 4 个基因岛。研究表明,湛江地区患病对虾养殖池塘中的副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,发现了一个携带 pirAB 的新 ST 型(ST1740)菌株,其携带 4 种来自希瓦氏菌的基因岛且为多重耐药菌株,本研究首次在副溶血性弧菌中发现来自希瓦氏菌属的基因水平转移,这些结果为防治急性肝胰腺坏死病提供了科学依据。关键词:副溶血性弧菌;凡纳滨对虾;药敏试验;多位点序列分型中图分类号:S 917.1;Q 93.3 文献标志码:A 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性菌,广泛分布于世界各地温暖的河口和海洋环境中。近年来,由于海鲜消费的增加,生食或未煮熟海鲜中的副溶血性弧菌正成为急性胃肠炎的主要病因1。2010 年,由副溶血性弧菌引起的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)急性肝胰腺坏死病(AHPND)在中国首次被发现2-3,随后在越南、马来西亚、泰国和墨西哥等国家的对虾养殖区域也相继发现,严重威胁着全球的对虾养殖业健康发展4-5。在最近的一项研究中,通过对导致出现凡纳滨对虾 AHPND 症状的副溶血性弧菌菌株进行基因组测序,揭示了与 PirAB(PirA、PirB)同源的毒力基因6-7。Tran 等8研究发现,AHPND 病原体是一种特异性的副溶血性弧菌,这种变异菌株因其获得了表达致命毒素(PirAB)的质粒而具有较高的致病性9-10。这些结果表明,PirAB 是导致出现AHPND 症状的主要毒力因子10。除此之外,副溶血性弧菌还拥有许多其他的毒力因子,包括黏附素、热稳定直接溶血素(TDH)及其相关溶血素(TRH)、MAM7、两种型分泌系统(T3SS1 和T3SS2)和两种型分泌系统(T6SS1 和 T6SS2)等11-12。湛江位于中国大陆最南端,因其丰富的海洋资源已成为中国最大的对虾养殖基地,其产量约占全国的 1/513。然而,对该地区对虾养殖池塘内的副 收稿日期:2022-02-26 基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”项目(2019YFD0900503);国家自然科学基金(81903372);辽宁省教育厅科研项目(QL202005)作者简介:吴俊敏(1997),女,硕士研究生。E-mail:1159777688 通信作者:傅松哲(1985),男,博士,副研究员。E-mail:fusongzhe 溶血性弧菌遗传多样性一直缺乏系统性研究。邓传燕等14对广东、广西沿海 4 地的鱼苗场取样进行了耐药性分析,发现有 66.7%的菌株同时对 30 种以上抗生素具耐药性,并发现了高耐药菌株。高玉龙等15通过对分离自广东省阳江市养殖区的 88株弧菌进行鉴定和药物敏感试验发现,88 株弧菌属于不同的 13 个种,并且所有菌株均对阿莫西林、四环素等抗生素耐药,同时也显示出多重耐药的性质。马聪等16研究了 20082010 年广东地区 23起副溶血性弧菌暴发患者临床样本和当餐食品分离株的基因型和耐药性,发现 98.6%的分离菌株均携带 tdh 毒力基因。本研究中,通过 20182020年对广东省湛江市和茂名市对虾养殖池塘进行取样,从中分离副溶血性弧菌,并对其进行多位点序列分型(MLST)、毒力基因携带检测情况及耐药性等病原学特性表征,以期为该地区副溶血性弧菌的防治提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料样品:湛江地区凡纳滨对虾养殖池塘的表层水和沉积物。试剂:青霉素、环丙沙星、克拉霉素、氨苄西林、四环素、卡那霉素、红霉素、利福平、庆大霉素、复方新诺明、氧氟沙星和左氟沙星 12 种抗生素药敏纸片购自杭州微生物试剂公司;TCBS 培养基、LB 琼脂培养基、副溶血性弧菌显色培养基和PCR 扩增试剂均购自青岛海博生物技术有限公司。1.2 方法1.2.1患病对虾池塘水样和底泥的采集分别于20182020 年每年的 5 月和 11 月,在湛江的两个凡纳滨对虾养殖池塘(S1 和 S2)和茂名的一个养殖池塘(Z1)进行取样。采样点坐标分别为 S1(1102397E,210282N)、S2(1105972E,211243N)和 Z1(1109007E,215383N)。分别采集发生急性肝胰腺坏死病的对虾养殖池塘中表层水及沉积物样本。其中,采样点 S1 和 S2 养殖对虾为 3 个月,在养殖期间未换水,水中盐度分别为 1.2 和 1.9,人工投喂饲料,养殖池体积为24 m3;Z1 为全年养殖,不定期换水,水中盐度为13.98,人工投喂饲料。使用水体采集器在池塘四角及中央采集水面表层 0.5 m 处水样各 1.5 L;同时在相同位置,使用采集器采集沉积物样本 200 g装入采集袋中。将采集的所有样品置于 4 冰盒中保存,带回实验室后对水样和底泥样本进行处理。1.2.2 菌株分离纯化在超净工作台上,将表层水样用生理盐水进行梯度稀释后,取 200 L 均匀涂布于 TCBS 琼脂培养基上;取沉积物样本 25 g,加入 225 mL 体积分数为 3%的氯化钠碱性蛋白胨水(361)中增菌 8 18 h,取 200 L 涂布于TCBS 培养基上。将经过处理后的表层水样、沉积物样本置于 37 恒温培养箱内培养 2024 h,观察菌落形态。将培养出的单菌落进行划线纯化,挑取 TCBS 平板上的疑似副溶血性弧菌的蓝绿色单菌落接种到 LB 培养基上,过夜培养后,于-80 超低温冰箱中保存。1.2.3 菌株鉴定 挑取 TCBS 平板上疑似副溶血性弧菌的蓝绿色单菌落,按照 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验 GB 4789.72013 对其进行生化鉴定,生化试验呈阳性的菌株利用细菌基因组 DNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取基因组 DNA。对菌株 16S 基因进行 PCR 扩增。PCR 反应体系(共 25 L):DNA 模板 2.5 L,上、下 游引物各 0.5 L,Premix Taq 12.5 L,无菌水 9 L。本试验中用引用信息见表 1,PCR 扩增产物经脉冲场凝胶电泳分析后,选取条带明亮的样品送至生工生物工程(上海)股份 有 限 公 司 进 行 测 序,测 序 结 果 在 NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对。表 1 本试验中的引物信息Tab.1 Primer information in this experiment目标基因 target引物序列 primer sequence(5-3)16S rDNAF:GAGTTTGATCCTGGCTCAGR:TACGGTTACCTTGTTACGACTTtdhF:CTAAATAGGGCTGTTCGGCTR:GAAAAGGGACAGATGGAAGCtrhF:CTTTTCCTTCTCCAGGTTCGR:CAGAAAGAGCAGCCATTGTGtlhF:AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTGR:GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCmam7F:CTTAGAAAGCATGAGCGCCCTACR:GATGATGGAACCGACCACAATACvcrD1F:ACGCTATTTCGTTTGTCCCTGTCR:GCTTTCTGATTCGGTTTGCTTTTvcrD2F:TATGGCATGTGGTGTCTATTTGR:CGCTACGCAGTGTAGTTTGTACpirAF:TGACTATTCTCACGATTGGACTGL:CACGACTAGCGCCATTGTTA1.2.4 药物敏感性试验采用纸片扩散法,对副溶血性弧菌进行 12 种常见的抗生素药物敏感性试验。挑取纯化培养1824 h 的副溶血性弧菌单菌落06大连海洋大学学报 第 38 卷制成菌悬液,用移液枪吸取 200 L 菌悬液,涂布于 LB 培养基上,将药敏片均匀贴于表面,28 恒温培养箱内培养1824 h 后测量抑菌圈直径。记录各类药物对副溶血性弧菌菌株产生的抑菌圈直径,并根据 CLSI 第三版标准17对结果进行判定。1.2.5副溶血性弧菌毒力基因检测采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取副溶血性弧菌基因组DNA,对分离的 58 株副溶血弧菌进行毒力基因检测,采 用 PCR 对 tdh、trh、tlh、mam7、vcrD1、vcrD2 和 pirAB 等毒力基因进行检测。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物信息见表1。PCR 产物于凝胶电泳15 min 后,使用凝胶成像系统分析结果。将明亮条带送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。1.2.6 多位点序列分型 对分离的 58 株副溶血弧菌进行 MLST 分型,首先选择副溶血性弧菌的 7 个管家基因(dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC和 tnaA)作为本试验的目的基因,7 个管家基因位点与参数见表 2。引物来源参考 PubMLST 网络数据库,7 对 PCR 引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反应体系(共 25 L)为 Premix Taq 12.5 L,上、下游引物各 0.5 L,模板 2 L,无菌水 9.5 L。PCR 扩增反应条件参照 PubMLST 网络数据库公布的副溶血性弧菌的标准方案进行:96 下预变性 5 min;96 下变性1 min,58 下退火1 min,72 下延伸 1 min,共进行 30 个循环;最后在 72 下再延伸 10 min18。PCR 产 物 送 测 序 公 司 测 序 后,将 序 列 提 交 到PubMLST 官网数据库(http:/pubmlst.org/vparah-aemolyticus/)中进行比对,确定菌株的 ST 型。采