孕激素诱导耐药的子宫内膜癌细胞生物学特性的比对分析_邢宝玲.pdf

解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1论著【摘要】目的探讨孕激素诱导耐药子宫内膜癌细胞的生物学特征，为治疗耐药子宫内膜癌提供实验依据。方法以子宫内膜癌 Ishikawa 细胞（IS）为母代，建立孕激素耐药细胞（PR）；通过 CCK8、流式细胞术对比PR 细胞与IS细胞的表型特征；通过RTPCR、Western blotting、PCR+毛细管电泳、RNA 测序技术进行PR 细胞、富含 AT 的结合域 1A（ARID1A）敲除细胞（ARID1A KO）和 MUTL 同源物 1（MLH1）敲除细胞（MLH1 KO）的 B 型孕激素受体（PRB）表达量、ARID1A 表达量、微卫星不稳定（MSI）、基因转录组的检测对比。结果与IS细胞相比，PR细胞凋亡率增高（P=0.026，P0.05）、G0/G1期细胞比例增高（P=0.041，P0.05）及 S 期细胞比例降低（P=0.018，P0.05），差异有统计学意义，PR 细胞增殖率差异无统计学意义（P0.07）；与 IS 细胞相比，PR 细胞的 ARID1A mRNA 和蛋白表达量差异无统计学意义（分别为 P=0.79 和 P=0.64），PR细胞无 MSI，ARID1A KO 和 MLH1 KO 细胞中 PRB 的 mRNA 和蛋白表达量下降，差异有统计学意义（均 P0.05）；与 ARID1A KO 和 MLH1 KO 细胞相比，PR 细胞与 IS 细胞的基因转录组信息更相近。结论与 ARID1A 突变和 MLH1 突变的癌细胞相比，孕激素诱导耐药癌细胞的生物学特性与其母代子宫内膜癌细胞更相似。【关键词】子宫内膜癌；孕激素；B型孕激素受体；富含AT的结合域1A；微卫星不稳定；基因转录组基金项目：上海市浦东新区科技发展基金（PKJ2020Y45）DOI：10.20021/ki.16710770.202.0.02Comparative analysis of biological characteristics of endometrial cancer cell line with progesterone inducedresistanceXING Baoling，ZHANG Yongying，RONG Danping，XIANG Lintao，ZHU HuiDepartment of Pathology，Affiliated Zhoupu Hospital of Shanghai University of Medicine and Health Sciences，Shanghai 201318，ChinaCorresponding author：XING Baoling，Email：【Abstract】ObjectiveTo investigate the biological characteristics of endometrial cancer cell line with progesteronereduced resistance by compared to different cells.MethodsAprogestinresistance cell line（PR）was established by using endometrial carcinoma Ishikawa cells（IS）.By CCK8，flow cytometry，the phenotypic characteristics of PR cells and IS cells were compared.By RTPCR，Western Blot，PCR+capillary electrophoresis，and RNAsequencing，PR，ATrich binding domain 1A Containing protein 1A（ARID1A）knockout cells（ARID1A KO）andMutL homolog 1（MLH1）knockout cells（MLH1 KO）were identified for progesterone receptor type B（PRB）expression，ARID1A expression，Microsatellite Instability（MSI），gene transcriptome detection.ResultsCompared withIS cells，the higher apoptosis rate（P=0.026，P0.05），the higher proportion of cells in G0/G1phase（P=0.041，P0.05）and the lower proportion of Sphase cells（P=0.018，P0.05）of PR cells was statistically significant，the difference of the proliferation rate（P=0.07）of PR cells was not statistically significant.Compared with IS cells，thedifference of ARID1A mRNA and protein expression（P=0.79，P=0.64）of PR cells was not statistically significant，there was no MSI in PR cells，the lower mRNA and protein expressions of PRB of ARID1A KO and MLH1 KO cells孕激素诱导耐药的子宫内膜癌细胞生物学特性的比对分析邢宝玲，张咏英，戎丹平，项霖涛，朱慧上海健康医学院附属周浦医院病理科，上海201318通讯作者：邢宝玲，Email：713解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1（P0.05，P90%，离心取上清。使用 BCA 蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白浓度测定，取 80 l 裂解液加入 20 l 5SDSPAGE 蛋白上样缓冲液，沸水煮 5 min。20 g 上样量进行蛋白SDSPAGE 电泳，BioRad 半干法转印到 PVDF 膜后，用2%BSA 溶液封闭1 h，鼠抗PRB单克隆抗体或兔抗 ARID1A 单克隆抗体 4过夜孵育，用连接了HRP的兔抗或鼠抗37孵育1 h，按照1 1的比例配制 ECL 化学发光液，均匀滴加于 PVDF 膜上后，使用凝胶成像系统检测发光。1.2.3实时荧光定量RTPCR检测PRB和ARID1A的mRNA表达水平TRIzol法提取细胞总RNA，用8解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1Nanodrop 1000检测RNA浓度和纯度；按照AccessQuick RTPCR System 的步骤进行逆转录及 cDNA扩增；利用pUC18质粒，构建pUC18PRB和pUC18ARID1A质粒，质粒浓度利用紫外分光光度计进行测量后，依次进行10倍稀释，设空白对照，绘制标准曲线。将 GoTaq qPCR Master Mix 加入样品中，用 MA6000 型实时荧光定量 PCR 仪进行 RTPCR反应，定量分析PRB mRNA及ARID1A mRNA的含量，用 copies/ml 表示。PRB 的引物序列：Forward：5 GTATTTGTGCGTGTGGGTGG3，Reverse：5GTGGGGAGCGCAAGAAAAAG3；ARID1A 的引物序列：Forward：5GGAGATGTACAGCGTGCCAT3，Reverse：5AGAGGTGCGGTTCTCCATTG3。1.2.4CCK8法检测细胞的增殖能力用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力，以 2103细胞/孔的浓度100 L 种植于 96 孔细胞培养板，每组 4 个复孔，培养6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，丢弃培养液，加入含有CCK8的DMEM高葡萄糖液继续在37孵育2 h，全自动酶标仪在波长450 nm条件下读取每孔的吸光度（A）值。1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡率按照Annexin凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，以5 105细胞/孔，每组3个复孔，冷冻的PBS清洗，用 100 L 1AnnexinV Binding Buffer重悬细胞；每100 L细胞悬液，添加5 l Annexin V AbFluorTM 488和2 l PI，室温下，暗处理细胞 15 min；冰上添加 400 l 1 Annexin VBinding Buffer，30 min 内流式细胞仪的 532 nm（FITC channel）和 617 nm（PI channel）通道检测。1.2.6流式细胞术检测细胞周期按照细胞周期检测试剂盒检测细胞周期，取2106细胞/孔，每组3 个复孔，用预冷的 PBS 洗涤细胞，600 g 离心 5min，除去上清，用预冷的 70%乙醇缓慢重悬细胞，将细胞在-20下放置 24 h固定；4 1 000 g 离心5 min，除去乙醇；将细胞重悬于 1 mL 预冷 PBS中，4 500 g 离心细胞 10 min，重复 2 次；将细胞重悬于 0.5 mL 染液中，在黑暗中 37孵育 30min；用 PBS 洗涤细胞，24 h 内在流式细胞仪的通道（Ex/Em=535/615 nm）分析细胞。1.2.7PCR 及毛细管电泳法检测 MSI吸去贴壁细胞的培养基，刮取细胞转移到离心管，加入蛋白酶 K 及缓冲液 GB，充分混匀，溶液清亮后，加人200 l 无水乙醇，将溶液加入吸附柱CB3中，充分洗涤，将吸附柱CB3转入另一个离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50200 l 洗脱缓冲液TE，离心后，将溶液收集到离心管中；测定纯化后的 DNA 浓度，以 100 ng/l 的投入量进行 PCR 反应，PCR反应试剂为TaKaRa Ex TaqHot Start Version。MSI 检 测 选 取 贝 斯 塔 遗 传 标 记：Bat26、Bat25、D5s346、D2s123和D17S250。PCR扩增产物在 ABI3500 Genetic Analyzer 上进行毛细管电泳，用GeneScan软件进行数据分析。1.2.8RNA测序（RNA sequencing，RNAseq）检测细胞的转录组特征TRIzol 法提取细胞总 RNA，检测 RNA 浓度和纯度，将富集获得的 mRNA 打断为短片段，并逆转录为互补 cDNA（complementaryDNA，cDNA），对其进行修复及适当修饰并进行筛选，筛选后通过 PCR建立cDNA文库。对cDNA文库进行检测确认其符合后续实验要求，上机测序。用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG，www.kegg.jp/kegg/kegg1.html）数据库 及R软件进行通路富集分析，使用Hisat2将两头测序的序列与参考基因组 GRH37 进行比较，根据比对结果，使用Counts v1.5.0函数对每个基因的序列进行计数，绘制该基因的读取计数。采用 DESeq2（1.10.1）进行两组间差异表达分析。用Benjamini和Hochberg的方法对所得的 P 值进行了调整，以控制 FDR（falsediscovery rate）。AQ 值 1为显著差异表达的阈值。1.3统计学分析采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料以均值 标准差（MeanSD）表示，各组间数据的比较依据资料的性质，采用 t 检验或方差分析。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1孕激素耐药的PR细胞诱导成功PR细胞在含40 mol/L MPA 培养基中的生长速率与母