右美托咪定通过P2X7调控...L-1β通路减轻大鼠炎性痛_李屹.pdf

中出血量及术后机体氧化应激反应的影响J 肿瘤基础与临床，2017;30(6):523-5.2杨庚，李昱，贺亚峰.miNA-19a 对结肠癌 LoVo 细胞生物学特性影响的机制研究 J 国际检验医学杂志，2018;39(5):530-3.3郑俊俊，毛玉娣，汪朝靓，等.结肠癌组织中 miNA 表达谱的变化 J 安徽医科大学学报，2019;54(3):348-53.4孙垭娉，张俊峰.miNA-223 在心血管疾病中的研究进展 J 心脏杂志，2019;31(1):95-9.5Yang F，Xu Y，Liu C，et al NF-B/mi-223-3p/AID1A axis is in-volved in Helicobacter pylori CagA-induced gastric carcinogenesis andprogression J Cell Death Dis，2018;9(1):12.6邱嘉华.microNA-21、microNA-135b 和 microNA-141 在结肠癌组织中的表达及相关性J 国际检验医学杂志，2017;38(17):2424-5.7徐俊，陈旭.结肠癌辅助化疗的研究进展 J 医学综述，2017;23(20):4039-44.8Banerjee A，Pathak S，Subramanium VD，et al Strategies for targeteddrug delivery in treatment of colon cancer:current trends and futureperspectives J Drug Discovery Today，2017;22(8):1224-32.9杜飞，董亚萍，朴成钢.结肠癌靶向治疗的研究进展 J 生命的化学，2018;38(2):259-66.10程钧.miNA 对结肠癌调控机制的研究进展J 西部医学，2018;30(1):154-6.11李伦，兴成娟，丛玲，等.mi-223-3p 靶向上皮细胞转化序列 2基因调控胃癌细胞周期和凋亡的相关性研究 J 世界华人消化杂志，2018;586(2):14-22.12罗吉，罗燕，李勇敏，等.重楼皂苷对结肠癌 HCT116 细胞凋亡及 Bax，Bcl-2，Caspase-3 蛋白表达的影响 J 中国实验方剂学杂志，2018;24(6):172-6.2022-05-27 修回(编辑滕欣航)右美托咪定通过 P2X7 调控 NLP3/IL-1 通路减轻大鼠炎性痛李屹张际政孙晓华车津立任万陆(天津医院麻醉科，天津300211)摘要 目的探讨右美托咪定(Dex)在慢性炎性痛大鼠模型中对嘌呤能 P2X7 及 NOD 样受体蛋白(NLP)3/白细胞介素(IL)-1 通路的影响。方法将 60 只大鼠随机分为对照组、模型组、Dex 低、高剂量组(10、20 g/kg)、Bz-ATP 组(Dex20 g/kg+P2X7 激动剂 Bz-ATP 15 g/kg)，每组 12 只。左后爪足底内注射完全弗氏佐剂(CFA)诱发炎性疼痛模型，大鼠于建模前 1 d、建模后即刻及建模后 1、2、3 d 进行腹腔注射给药，1 次/d。给药结束后，行为学测试检测大鼠机械痛阈(MWT)和热痛阈(PWTL);酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑脊液中 IL-1 水平;分离 L4 L6 背根神经节(DG)，免疫荧光法检测 DG 中P2X7、NLP3 与神经元特异核蛋白(NeuN)的共表达;蛋白免疫印迹法检测 DG 中 P2X7、NLP3、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1、IL-1 蛋白表达。结果与对照组相比，模型组 MWT、PWTL 显著下降(P0.05);脑脊液中 IL-1，DG 中 P2X7与 NeuN、NLP3 与 NeuN 共表达水平、P2X7、NLP3、Caspase-1、IL-1 蛋白表达均显著升高(P0.05)。与模型组相比，Dex 低、高剂量组 MWT、PWTL 明显升高(P0.05);脑脊液中 IL-1，DG 中 P2X7 与 NeuN、NLP3 与 NeuN 共表达水平、P2X7、NL-P3、Caspase-1、IL-1 蛋白表达均明显降低(P0.05)，且使用 Bz-ATP 激活 P2X7 受体，可明显逆转 Dex 的抗炎镇痛作用。结论Dex 可能通过下调 P2X7，抑制 NLP3/IL-1 通路，减轻大鼠慢性炎性痛。关键词 右美托咪定;慢性炎性痛;嘌呤能 P2X7 受体;NOD 样受体蛋白 3;白细胞介素 1中图分类号 969.4 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0734-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.055通信作者:任万陆(1967-)，男，副主任医师，主要从事急危重症创伤麻醉研究。第一作者:李屹(1969-)，男，主治医师，主要从事创伤麻醉研究。炎性疼痛是常见的临床症状，广泛存在于各种急慢性疾病中。一般情况下，急性炎症对于保护身体免受入侵的病原体及促进组织重塑和修复至关重要。持续 6 w 或更长时间的慢性炎症是严重影响患者生活质量的最常见不适之一，可导致组织损伤1。促炎介质(如前列腺素、细胞因子、趋化因子、蛋白酶、神经肽和生长因子)在炎症部位释放能够使周围的痛觉神经元敏感。目前，非甾体抗炎药和阿片类镇痛药仍是临床上常用的药物，但近 50%的患者会感到疼痛缓解不足、胃肠道不适和其他严重的副作用(如便秘、抑郁)2，3。因此，开发高效、低毒的镇痛药一直受到医学界的关注。右美托咪定(Dex)是一种具有镇静、镇痛、辅助麻醉等作用的新一代高选择性 2 肾上腺素能受体(2 A)激动剂;是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的在重症监护病房(ICU)中对插管和机械通气患者进行镇静的常用药物4。研究发现其具有显著的抗炎镇痛作用，对2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠慢性炎性内脏痛表现较强的镇痛作用5，6;研究发现Dex 区域麻醉干预对术后镇痛非常有用，可以减少对阿片类药物的需求并提高术后患者的满意度7。嘌呤能 P2X7 已被证明在伤害性炎症和神经性437中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷疼痛的动物模型中起核心作用，在患有慢性伤害性和神经性疼痛的患者外周血中可见 P2X7 明显上调和白细胞介素(IL)-1 释放增加8 10。动物研究也发现 P2X7 可通过激活 VOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLP)3/IL-1 信号通路，参与大鼠炎性痛的形成11。Dex 可抑制 P2X4 和 NLP3 的表达，减弱糖尿病性神经性疼痛大鼠12;并可下调 NLP3的表达，降低 IL-1 的释放，抑制小胶质细胞的炎症13。而 Dex 能否通过 P2X7 调控 NLP3/IL-1减轻大鼠炎性痛还未可知，故本研究通过建立慢性炎性痛大鼠模型，探讨 Dex 在该模型中对 P2X7 及NLP3/IL-1 通路的影响，为 Dex 能否作为安全、高效的镇痛药提供理论和实验依据。1材料与方法1.1材料SPF 级雄性 SD 大鼠 66 只，体重(18020)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证为 SCXK(京)2019-0009。将所有大鼠放在可控制的光照下保持 12 h 明暗交替，温度(20 2)，相对湿度为 45%60%，可以自由获取食物和水。研究已由机构动物护理和使用委员会批准，并遵循实验动物的护理和使用指南。盐酸 Dex注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20090248，2 ml:200 g);2(3)-O-(4-苯甲酰苯甲酰)腺苷 5-三磷酸三乙铵盐(Bz-ATP，P2X7 激动剂，93%，美 国 Sigma-Aldrich 公 司，CAS 号:112898-15-4);完全弗氏佐剂(CFA，P2036)、IPA裂解液(P0013B)和二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(P0012S)均购自碧云天生物科技公司;大鼠 IL-1(A20020)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司;兔抗 P2X7(ab109054)、NLP3(ab263899)、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1(ab238972)、IL-1(ab200478)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(ab9485)、羊抗兔 IgGHL 辣根过氧化物酶(HP)(ab205718)、小鼠抗神经元特异核蛋白(NeuN，ab104224)、Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔 IgG HL(ab150079)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠 IgG HL(ab6785)均购自英国 abcam 公司;BME-403 Von Frey、BME-410C 全自动热痛刺激仪均购自中国医学科学院生物医学工程研究所;iMark680 多功能酶标仪、蛋白转膜装置(美国 Bio-ad 公司);荧光显微镜(日本 O-lympus 公司)。1.2模型制备大鼠适应性喂养 3 d 后开始实验。将 60 只大鼠随机分为对照组、模型组、Dex 低、高剂量组(10、20 g/kg)12、Bz-ATP 组(Dex 20 g/kg+P2X7 激动剂 Bz-ATP 15 g/kg)11，每组 12 只。1%的戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，左后爪足底内注射 20 l 的 CFA 诱发炎症性疼痛模型14。大鼠于建模前 1 d、建模后即刻及建模后 1、2、3 d 进行腹腔注射给药，对照组和模型组注射生理盐水，Dex 低、高剂量组分别注射相应剂量的Dex，Bz-ATP 组在给予 Dex 的同时注射 P2X7 激动剂 Bz-ATP(溶于无菌的 0.9%生理盐水中，并稀释至所需浓度)，1 次/d，注射体积为 1 ml。1.3行为学测试1.3.1机械痛敏在大鼠注射前 1 d 及给药结束后 30 min 进行机械痛敏测定。实验前将大鼠连续3 d放置在测试笼中 30 min 以适应测试环境，每次测试前，将大鼠放进测试笼中适应15 min，然后用电子 Von Frey 刺激针刺激大鼠左侧足底，从 1.0 g 开始，逐渐增加纤毛折力，记录出现抬足或舔足反射的最小刺激强度为机械缩足反射阈值(MWT)，每只大鼠测量 5 次，每次间隔 5 min，计算其平均值。1.3.2热痛敏分别用移动的热辐射光源照射各组大鼠左侧足底，大鼠快速抬足或舔足即停止照射，记录热辐射持续时间即缩足反射潜伏期(PWTL)，每只大鼠测量 5 次，每次间隔 5 min，计算其平均值。为避免灼伤大鼠足底，刺激时间设置为 15 s，若 15 s内大鼠对热刺激无反应则记为 15 s。1.3.3ELISA 检测脑脊液 IL-1 水平行为学检测结束后，使用戊巴比妥(80 mg/kg)深度麻醉大鼠，固定于脑立体定位仪上，剪开枕骨嵴附近皮肤，使用微量进样器穿过肌肉进入延髓池，缓慢抽取100 l 脑脊液，80 冰箱保存。按照 ELISA 试剂盒说明书的操作检测脑脊液中 IL-1 水平。1.3.4免疫荧光检测背根神经节(DG)中 P2X7、NLP3 与 NeuN 的共表达取脑脊液完成后处死大鼠，经心灌注 150 ml 生理盐水和 400 ml 4%多聚甲醛的 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲盐水(PBS)。分离 L4 L6 DG，每组随机选取6 只大鼠的样本，在4%多聚甲醛中固定 3 h，然后转移至 15%和 30%的蔗糖进行脱水。OCT 包埋后在冷冻低温恒温器上将 DG切成 14 m 的切片。将切片用 TBST(0.1%Tween-20)冲洗，并在37下用5%正常山羊血清封闭1 h。然后将切片与兔抗 P2X7(1 100)、NLP3(1 100)和小鼠抗 NeuN(1200)于 4孵育过夜。清洗后，与Alexa Fluor 647 标记的山羊抗兔和 FITC 标记的山羊抗小鼠二抗 IgG 抗体(1 200)进行第二次孵育2 h。46-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育 30 min，漂洗后使537李屹等右美