造血干细胞移植条件对小鼠造血重建的影响_肖方楠.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 1 期 124 130Current Biotechnology ISSN 2095-2341研究论文研究论文Articles造血干细胞移植条件对小鼠造血重建的影响肖方楠，吕雪*，袁佳佳，张明英，邢文，周圆中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所），北京协和医学院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心，细胞生态海河实验室，天津 300020摘 要：通过同种基因型小鼠构建造血干细胞移植模型，将预处理的全骨髓单个核细胞或c-Kit+造血干细胞移植至致死剂量照射的受体小鼠体内，动态监测移植216周后受体小鼠体内供体来源细胞造血重建以及嵌合情况，以期揭示不同群体的供体细胞以及预处理等因素对小鼠造血干细胞移植后造血重建的影响。实验结果显示，移植后早期（2周）全骨髓单个核细胞组髓系比例要高于c-Kit+细胞移植组，但全骨髓移植组受体小鼠呈现出较大的移植后不良反应，出现脱毛、食欲不振以及体重减轻的症状。c-Kit+细胞移植组在淋系重建上要早于全骨髓移植组，供体细胞的嵌合植入也早于全骨髓移植组，但两组实验组最终均能完成造血重建过程。实验结果表明c-Kit+细胞移植组在移植后能够较快地实现供体细胞植入，进而开始造血重建，且c-Kit+细胞移植组的不良反应要低于全骨髓移植组。结果说明在整体造血重建效果上c-Kit+细胞移植组要优于全骨髓移植组。关键词：造血干/祖细胞；造血干细胞移植；造血重建DOI：10.19586/j.20952341.2022.0180 中图分类号：R-392；R457.7 文献标志码：AThe Effect of Hematopoietic Stem Cell Transplantation Conditions on Hematopoietic Reconstruction in MiceXIAO Fangnan，LYU Xue*，YUAN Jiajia，ZHANG Mingying，XING Wen，ZHOU YuanState Key Laboratory of Experimental Hematology，Haihe Laboratory of Cell Ecosystem，National Clinical Research Center for Blood Diseases，Institute of Hematology&Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical，Tianjin 300020，ChinaAbstract：By means of mouse hematopoietic stem cell transplantation model，pretreated whole bone marrow mononuclear cells or c-Kit+haematopoietic stem cell were transplanted into lethally irradiated recipient mice，and the hematopoietic reconstruction and chimerism of donor-derived cells in recipient mice were dynamically detected within 216 weeks after transplantation.We revealed the influence of donor cells types pretreatment conditions on the hematopoietic reconstruction after hematopoietic stem cell transplantation in mice.The results showed that the proportion of myeloid reconstruction（2 weeks）in the whole bone marrow mononuclear cell transplantation group was higher than that in the c-Kit+cell group，but the recipient mice in the whole bone marrow transplantatino group showed larger transplant rejection，which were manifested by hair removal，loss of appetite and weight loss.The c-Kit+cell transplantation group preceded the whole bone marrow group in the gonoetic reconstruction，and the chimeric implantation of donor cells also preceded the whole bone marrow transplant group，but both experimental groups were able to achieve hematopoietic reconstruction.In addition，the laser strike of the flow cytometer can lead to the phenomenon of fluorescence quenching of donor cells to a certain extent.It can be conclued that the c-Kit+cell transplant group achieved hematopoietic stem cell implantation relatively quickly after transplantation，so as to start hematopoietic reconstruction，and in terms of receptor response，the adverse reactions in the c-Kit+cell group were much lower than those in the whole bone marrow group.In terms of overall hematopoietic reconstruction effect，the c-Kit cell group was superior to the whole bone marrow transplant group.Key words：hematopoietic stem/progenitor cells；hematopoietic stem cell transplantation；hematopoietic reconstruction收稿日期：20221104；接受日期：20221130基金项目：国家自然科学基金项目（81970120；82270148）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2022-I2M-2-003）。联系方式：肖方楠 E-mail：；*通信作者 吕雪 E-mail：肖方楠，等：造血干细胞移植条件对小鼠造血重建的影响造血干细胞（haematopoietic stem cell，HSC）是一群具有自我更新以及多向分化潜能的特殊细胞群体，通过定向分化形成各系造血祖细胞及成熟血细胞，在维持血液系统稳态上起着至关重要的作用。在造血干细胞分化模型中，逐级向下分化为长期造血干细胞（long-term haematopoietic stem cell，LT-HSC）和短期造血干细胞（short-term haematopoietic stem cell，ST-HSC）。体内移植研究已经证实，ST-HSC可以维持 68周的正常造血功能，而 LT-HSC则能维持生命体整个生命周期内正常造血群体和细胞类型1。正是由于造血干细胞具有自我更新以及多向分化潜能的特殊性质，自1957年起，临床上应用造血干细胞移植策略治疗血液以及自身免疫性等疾病2-3。目前临床上利用 CD34+的造血干祖细胞（haematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）作为供体细胞治疗肿瘤等疾病的手段已经相对成熟，为进一步提高临床治愈率、扩大应用范围及实现个体化治疗，已经研发出对HSPC进行基因修饰后进行移植的基因疗法4。如使用病毒载体修饰HSPC的药物已经获准应用于临床，此外使用CRISPR-Cas9等基因编辑技术对HSPC进行位点特异性修饰的方案也具有广阔的临床应用前景5-7。而HSPC经过基因编辑等预处理后是否能完成造血重建以及会发生何种不良反应尚不明确，仍需进一步研究。在基础研究中常通过小鼠造血干细胞的移植模型来探究血液系统疾病的机制。全骨髓单个核细胞、利用磁珠富集的c-Kit+细胞群体以及通过流式分选得到纯度更高的造血干细胞均可作为移植的供体细胞。此外，根据实验要求的不同，还会对供体细胞进行病毒感染、分选等预处理后再进行移植。但供体细胞植入后，能否持久并有效地进行重建还受到供体细胞质量、来源以及骨髓微环境等多种因素的影响。已有研究表明，骨髓微环境中活性氧的水平以及细胞因子的含量等可以显著影响移植后供体细胞的植入情况，而使用抗氧化药物改善骨髓微环境以及适当升高微环境中IL-6、TNF-等细胞因子水平将有助于造血干细胞的植入并降低植入后不良反应的发生率8-11。但不同供体细胞的选择是否会影响移植后的造血重建效果以及预处理操作对移植效果产生何种影响尚不十分清楚。本研究选用小鼠移植实验中最常见的2种供体细胞，即全骨髓单个核细胞（whole bone marrow mononuclear cells，BMNCs）和c-Kit+造血干细胞进行移植，并对2种供体细胞进行病毒感染，以探究不同来源的供体细胞以及供体细胞的预处理对移植后重建的影响。在进行造血干细胞移植后，对各系造血重建的检测是评估移植效果的重要指标。前期研究表明移植2周后便会出现粒细胞的重建，在68周出现B细胞重建，最后进行T细胞重建12。因此，我们通过检测移植后小鼠外周血成分的动态变化以及小鼠移植后的状态来比较不同供体细胞以及预处理因素对移植效果的影响，以期为造血干细胞的移植研究提供参考。1材料和方法1.1实验动物供体小鼠C57BL/6J（白细胞抗原表型为45.2）和受体小鼠B6.SJL（白细胞抗原表型为45.1）均由本单位实验动物中心自主繁育。所有实验用鼠均饲养于中国医学科学院血液学研究所SPF级动物房，且所有用于实验研究的小鼠均得到中国医学科学院血液学研究所伦理委员会的管理与批准。实验选取 610 周的小鼠作为供体或者受体小鼠。1.2试剂与仪器小鼠骨髓 c-Kit 富集使用的 anti-mouse c-Kit（CD117）magnetic beads 及磁力分选器 LS柱均购自美天旎公司。流式分析以及分选所用到的单克隆荧光抗体包括：APC-Anti-CD117、FITC-Anti-CD45.1、APC-Anti-CD45.2、APC-cy7-Anti-Ly6G/Ly6C、PE-cy7-Anti-CD11b、PE-cy7-Anti-CD3、PE-percp 5.5-Anti-B220均购自eBioscience以及 Invitrogen公司。红细胞裂解液以及PBS粉末购自索莱宝公司。骨髓细胞冲洗液PBE为PBS+2%血清+2 molL-1EDTA配制。流式分选仪Aria 以及流式分析仪Cantoll均购自美国BD公司。1.3小鼠全骨髓单核细胞的获取