孕酮对OCTN2的抑制作用及对左旋肉碱肾脏排泄的影响_白梦如.pdf

中国现代应用药学 2023 年 1 月第 40 卷第 2 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 January,Vol.40 No.2 191 孕酮对 OCTN2 的抑制作用及对左旋肉碱肾脏排泄的影响 白梦如1，陈铭扬2，蒋惠娣2，马志媛1*(1.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院临床药学科，浙江省临床肿瘤药理与毒理学研究重点实验室，杭州 310006；2.浙江大学药学院药物代谢与分析实验室，杭州 310058)摘要：目的 考察孕酮对肉碱/有机阳离子转运体 2(carnitine/organic cation transporter 2，OCTN2)功能的影响，并探讨其是否通过抑制肾脏 OCTN2 功能改变左旋肉碱肾脏排泄，从而降低妊娠期血浆左旋肉碱浓度。方法 采用已构建的稳定高表达人 OCTN2 的 MDCK-hOCTN2 细胞模型，分别以米屈肼和氘代左旋肉碱为底物，考察孕酮对 OCTN2 的抑制作用。正常雌性 ICR 小鼠皮下注射孕酮，使其达妊娠晚期血清孕酮浓度，比较其与对照组小鼠左旋肉碱尿液排泄差异，以及血浆和各组织中左旋肉碱浓度差异。结果 孕酮显著抑制 OCTN2 对米屈肼和氘代左旋肉碱的摄取，半数抑制浓度分别为8.7 molL1和 14.0 molL1。孕酮给药组小鼠血清孕酮浓度为 4621 153 nmolL1，与妊娠晚期生理浓度相当，左旋肉碱的尿液排泄量以及血浆、肝脏、肾脏和心脏中左旋肉碱浓度与对照组无显著差异。结论 孕酮显著抑制 OCTN2 功能，但与妊娠晚期生理浓度相当的孕酮不影响左旋肉碱的肾脏排泄及体内稳态。关键词：肉碱/有机阳离子转运体 2(OCTN2)；左旋肉碱；孕酮；肾脏排泄 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2023)02-0191-06 DOI:10.13748/ki.issn1007-7693.2023.02.006 引用本文：白梦如,陈铭扬,蒋惠娣,等.孕酮对 OCTN2 的抑制作用及对左旋肉碱肾脏排泄的影响J.中国现代应用药学,2023,40(2):191-196.Activity Inhibition of Progesterone on OCTN2 and its Effect on L-Carnitine Renal Excretion BAI Mengru1,CHEN Mingyang2,JIANG Huidi2,MA Zhiyuan1*(1.Department of Clinical Pharmacy,Key Laboratory of Clinical Cancer Pharmacology and Toxicology Research of Zhejiang Province,Affiliated Hangzhou First Peoples Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310006,China;2.Laboratory of Drug Metabolism and Pharmaceutical Analysis,College of Pharmaceutical Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the effect of progesterone on the activity of carnitine/organic cation transporter 2(OCTN2),and explore whether progesterone can reduce plasma L-carnitine concentration during pregnancy by inhibiting the renal OCTN2 activity and changing the renal excretion of L-carnitine.METHODS Used the established MDCK-hOCTN2 cell model with stable and high expression of human OCTN2,the inhibitory effect of progesterone on OCTN2 was investigated with mildronate and d3-L-carnitine as substrates.Normal female ICR mice were subcutaneously injected with progesterone to make their serum progesterone concentration reach the third trimester of pregnancy,then the urinary excretion of L-carnitine and L-carnitine concentrations in plasma and tissues were determined and compared with the control group.RESULTS Progesterone reduced the accumulation of mildronate or d3-L-carnitine in MDCK-hOCTN2 cells in a concentration-dependent manner,and the IC50 values were 8.7 molL1 and 14.0 molL1,respectively.The serum concentrations of progesterone were 4621 153 nmolL1 in the treated mice,which were equivalent to the physiological concentrations in late pregnancy.Compared with the control group,there were no significant differences in the urinary excretion of L-carnitine and L-carnitine levels in plasma,liver,kidney and heart of mice in the progesterone treated group.CONCLUSION Progesterone significantly inhibites the activity of OCTN2 in vitro,however,progesterone at levels observed in late pregnancy do not affect L-carnitine renal excretion and homeostasis.KEYWORDS:carnitine/organic cation transporter 2(OCTN2);L-carnitine;progesterone;renal excretion 基金项目：浙江省卫生健康科技计划项目(2021RC021)；杭州市医药卫生科技项目(A20210336)作者简介：白梦如，女，博士，主管药师 E-mail: *通信作者：马志媛，女，博士，副主任药师 E-mail:zhiyuan_ 左旋肉碱是体内重要的生理活性物质，广泛分布于哺乳动物的血液和各组织中，其生理作用是协助细胞质中的长链脂肪酸进入线粒体，促进脂肪酸 氧化1。左旋肉碱为亲水性的两性离子化合物，其被动扩散能力较弱，需要由转运体介导其跨细胞膜转运。肉碱/有机阳离子转运体 2(carnitine/organic cation transporter 2，OCTN2)，由 SLC22A5 基因编码，对左旋肉碱具有特异性高亲和力，参与左旋肉碱的细胞摄取，主要于成人肾脏、骨骼肌、胎 192 Chin J Mod Appl Pharm,2023 January,Vol.40 No.2 中国现代应用药学 2023 年 1 月第 40 卷第 2 期 盘、心脏和前列腺表达，脑、肺、肝脏也有一定表达2-3。左旋肉碱在体内不被代谢，经肾小球滤过以原型排至尿液中，而位于肾小管上皮细胞顶侧的 OCTN2 则介导了绝大部分左旋肉碱的重吸收，以维持左旋肉碱体内稳态1-2。OCTN2 功能障碍可导致体内左旋肉碱稳态失衡，而左旋肉碱缺乏会引起脂肪酸 氧化异常，进而导致心肌病、骨骼肌无力、低血糖和脂肪肝等一系列代谢性疾病4-7。研究表明，妊娠期女性的血浆左旋肉碱浓度随妊娠进行持续降低8-10，而血脂则逐渐升高11-12。笔者所在课题组前期研究显示妊娠小鼠血浆左旋肉碱浓度亦显著低于未妊娠小鼠13。孕酮亦称黄体酮，是一种天然孕激素，人和小鼠妊娠期血清孕酮浓度显著升高，妊娠足月时约为非妊娠期的数十倍14-15，且有文献报道孕酮可竞争性抑制 BeWo细胞摄取左旋肉碱16。妊娠期高浓度的孕酮能否通过抑制肾脏 OCTN2 功能改变左旋肉碱肾脏排泄，从而降低血浆左旋肉碱水平尚不清楚。因此，本研究首先利用稳定高表达人 OCTN2 的细胞模型考察孕酮对 OCTN2 功能的影响，进一步应用实验动物探究孕酮对左旋肉碱肾脏排泄的影响。1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 米屈肼(大连美仑公司，批号：J0920AS；纯度 98%)；氘 代 左 旋 肉 碱(Cambridge Isotope Laboratories 公司，货号：DLM-10961-PK；纯度98%)；左旋肉碱(批号：J1423007；纯度：98%)、孕酮(批号：L1909153；纯度：98%)均购自上海阿拉丁公司；胰酶(批号：1910485)、DMEM 高糖培养基(批号：1806525)、胎牛血清(批号：1908121)、青-链霉素溶液(批号：2018052503)均购自美国Gibco 公司；二甲基亚砜(DMSO，批号：SHBJ7919；纯 度 99.5%)、碘 化 N-甲 基-4-苯 基 吡 啶盐(MPP+，批号：911295-24-4)、十二烷基硫酸钠(批号：BCBZ6968；纯度99%)均购自美国 Sigma公司；茶油(浙江田雨山药用油有限公司，批号：20180401)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术研究所，批号：P0011)；乙腈(色谱纯，美国 Tedia 公司，批号：18095192)；其他试剂均为分析纯或更高级别。3111 型细胞培养箱(美国 Thermo 公司)；Centrifuge 5425R型 高 速 冷 冻 离 心 机(德 国Eppendorf 公司)；tissuelyser-48 型全自动样品快速研磨仪(上海净信科技公司)；GBL-88B 型涡旋震荡仪(海门市其林贝尔仪器公司)；1290-6460 型高效液相色谱-质谱联用仪(LC-MS/MS，美国 Agilent公司)；E170 全自动电化学发光免疫分析仪(瑞士Roche 公司)。1.2 细胞培养 稳定高表达人 OCTN2 的细胞模型 MDCK-hOCTN2 和对照细胞模型 MDCK-pcDNA3.1(+)(以下简称“mock”)由本实验室构建和保存17-18。MDCK-hOCTN2 和 mock 细胞培养在含 10%胎牛血清、1%青-链霉素的 DMEM 高糖培养基中，放置于37 和5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中，待细胞生长至 80%90%汇合度，用 0.25%胰酶消化传代。1.3 MDCK-hOCTN2 细胞功能鉴定 MDCK-hOCTN2 及 mock 细胞以每孔 2105的密度接种于 24 孔板，生长至 90%汇合度时进行米屈肼和氘代左旋肉碱(均为 OCT