有机框架材料在多肽富集的应用_赖心仪.pdf

Reviews and Monographs综述与专论生物化学与生物物理进展Progress in Biochemistry and Biophysics2023，50（3）：有机框架材料在多肽富集的应用*赖心仪1）王静楠1）胡筱1）林婉真1）许惠凤2）余丽双1）*（1）福建中医药大学药学院，福州 350122；2）福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福州 350122）摘要 生物医药领域近年来发展迅猛，多肽类药物因其生物学活性高、毒性小、生物相容性好等优势，在肿瘤治疗、细胞活性模拟、抗体检测等领域展开广泛应用，多肽的检测分析也成为研究的一大热点。传统的色谱法、溶剂沉淀法、离心超滤法和固相萃取法对多肽能够展现富集效果，但富集的效率往往不够理想。近年来，以有机框架材料为代表的纳米材料，在气体吸附、荧光、传感和催化等领域展开了广泛应用。有机框架材料凭借着独特的结构尺寸，成为了一类理想的生物吸附剂。由于其具有表面可修饰性，能够大大提高对多肽的富集效率。本文着重介绍近5年来金属-有机框架材料（metal-organic frameworks，MOFs）和共价-有机框架（covalent-organic frameworks，COFs）在多肽富集中的应用。关键词 多肽，富集，吸附，有机框架材料中图分类号 O658DOI：10.16476/j.pibb.2022.0179多肽是由多个氨基酸脱水缩合形成的一类化合物。通常将两个氨基酸脱水缩合而成的化合物称为二肽，由三个或者三个以上的氨基酸脱水缩合而成的化合物称为多肽1。多肽类药物由于其生物活性高、特异性强、与受体亲和力大、生物相容性好等独特优势，近年来备受生物医药市场青睐，在抗病毒、抗肿瘤、模拟细胞因子活性、抗体检测等方面展开了广泛应用。目前，多肽及其相关药物分析已成为生物医药研究的热点之一。多肽类药物来源广泛、成分复杂，直接检测相对困难。高丰度蛋白质、盐类、脂质等非肽成分会严重干扰多肽的检测信号，容易导致目标物的检测灵敏度变差。因此，不少研究者们试图采用一定的富集手段分离出目标肽，再对其分析鉴定。经富集后目标物受到的杂质干扰更小，检测背景更为清晰，检测信号的响应值更强。色谱法是早期多肽分离鉴定的一类经典方法，包括高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法等2-3。色谱法既能从样品中分离多肽，又能够检测到多肽相应的含量。但是，该方法需要耗费大量的试剂与时间，由于多肽的稳定性不佳，其结果往往并不够理想。随着仪器和设备的进步，多肽的分离方法相应得到了优化。其中，溶剂沉淀法、离心超滤法和固相萃取法这三种方法应用较多。上述方法规避了色谱法耗时久的缺点，能够简单快速地富集多肽4。但是，在实际定量分析时上述方法的富集损失较大，回收率较差。与色谱法相比，质谱法（mass spectrometry，MS）灵敏度更高、检测更迅速，是目前蛋白质和多肽鉴定分析应用较多的方法之一。纳米材料制备简单、理化性能稳定、生物相容性好，是一类理想的富集材料。微量的纳米材料通过上样、洗涤和洗脱三个步骤后，可对复杂生物样品中的目标肽实现快速高效富集。纳米材料具有丰富的孔径结构和大量结合位点，能够与多肽的基团相结合，从复杂样品中分离出目标肽，吸附于纳米材料表面，再将目标肽从纳米材料上洗脱，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、高效液相色谱联用质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）等技术进行分析鉴定。目前，磁性纳米颗粒、二氧化硅、石墨烯等纳米材料已经在蛋白质和多肽富集领域有所应用5。近年来，研究者们发现了一类在气体吸附6、国 家 自 然 科 学 基 金（82074005）和 福 建 省 自 然 科 学 基 金（2021J01925）资助项目。通讯联系人。Tel：0591-22861135，E-mail：收稿日期：2022-04-22，接受日期：2022-07-08 548 2023；50（3）生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.传感7、荧光8、催化9和药物传递10等方面具有重要应用的有机框架纳米材料，其能够对多肽展现出良好的富集性能。有机框架材料是一类有机晶态多孔纳米材料，它主要包括金属-有机框架（metal-organic frameworks，MOFs）、共价-有机框架（covalent-organic frameworks，COFs）和氢键-有机框架（hydrogen-organic framworks，HOFs）（图1）11-13。截止至2022年5月，Web of Science数据库可以分别检索到8万多条MOFs和6万多条COFs的相关文献，关于HOFs的文献仅统计到1万多条，与上述检索结果对比，HOFs的研究相对较少。有机框架材料的富集应用是近年来生物医药分析检测的一大突破，当前中外文数据库所收录的相关综述多以MOFs为主，关于COFs和HOFs两类有机框架材料在多肽富集应用的文献总结目前处于空缺阶段。MOFs 和COFs 在结构和功能上具有一定相似性，基于MOFs对多肽的捕获原理，近年来COFs在糖肽和磷酸肽的捕获方面有了新突破。本综述主要梳理总结近 5 年以来（20172022 年）以 MOFs 和COFs为代表的有机框架材料在多肽富集领域的应用，其中重点总结了MOFs和COFs对糖肽和磷酸肽的富集应用，旨在为多肽分析检测研究提供新思路。1MOFs应用于多肽富集MOFs是由金属离子（或簇）与有机配体配位连接而成的一类有机框架材料，是目前发展较快的一类金属多孔晶态材料。化学家们从1989年开始利用配位键构筑多孔框架材料，直到1997年才发现了具有永久性孔道的MOFs。MOFs合成简单、成本低廉，其金属离子大多为无毒金属，生物相容性相对较好。与其他纳米材料相比，MOFs表面含有大量不饱和金属位点，可通过氢键作用、静电作用、范德华力以及疏水作用等多种方式与多肽的糖基、磷酸基等基团发生亲和作用，从复杂样品中分离出目标肽14-15。MOFs具有超高的比表面积，可以提供大量活性位点，表面易于功能化修饰，可以满足各类型目标肽的富集要求。目前，MOFs在糖肽、磷酸肽、内源肽的富集中上均有应用。1.1MOFs在糖肽富集的应用蛋白质糖基化是蛋白质翻译后修饰的方式之一，糖蛋白不仅能够维持和支撑细胞结构，还参与细胞外分子识别、免疫应答和信号传导等多个过程。异常蛋白质糖基化与多种疾病直接相关，包括癌症、神经退行性疾病、肺部疾病、血液疾病和遗传性疾病等16-17。糖蛋白的信息分析手段不仅能增强人类对相关疾病的认识，也有助于解析异常糖基化疾病机理，为疾病的诊断和治疗提供更多的帮助。MS法具有高通量、高灵敏度、检测迅速等特点，是目前鉴定糖肽的有效方法之一。糖肽在实际样品中含量较少，糖肽利用MS法直接测得的信号强度普遍较弱，容易被高丰度的非糖肽物质所抑制。因此，在MS检测前，需要对复杂生物样品进行糖肽预富集18。根据富集机理不同，糖肽的富集方法主要有凝集素亲和色谱法、亲水相互作用色谱法、固定化离子亲和色谱法、氨联化学法、硼酸化学和金属氧化物法等19。以材料探针的方式捕获糖肽是目前较为新颖的一种富集策略。目前，生物基材料、有机高分子材料、功能化聚合材料等富集材料已经在糖肽富集领域有所应用20-21。普通MOFs与糖肽之间的亲和力弱、选择性差，实际富集效果往往不理想22。亲水性纳米材料在糖肽捕获方面具有优越的选择性和良好的重现性，不少研究者借鉴了其设计原理，试图通过引入亲水性基团、接枝亲水性物质以及复合Fig.1SEM images of organic framework materials图 1有机框架材料的扫描电镜图（a）MOFs 材 料：MIL-12511；（b）COFs 材 料：TbBDPEIAu4-MPBA 12；（c）HOsF材料：HOF-GS-10 13；（d）HOFs材料：HOF-GS-1113。赖心仪，等：有机框架材料在多肽富集的应用2023；50（3）549 磁性纳米材料等方式对普通MOFs进行亲水性修饰（图2）。目前已有不少亲水性MOFs应用于糖肽富集研究（表1）。MOFs的表面具有可修饰性，在MOFs表面引入氨基、羧基以及磺酸基等亲水性基团修饰后，可以合成一类亲水性功能化MOFs。Zhang等 23 合成了一类氨基功能化亲水性MOF材料MIL-101（Cr）-NH2。与MIL-101（Cr）相比，MIL-101（Cr）-NH2引入的氨基与糖基之间形成了氢键，亲水作用显著增强。该材料经过10 l人血清处理后，经LC-MS可鉴定42种糖蛋白和116种糖肽。Liu等24以对苯二甲酸（terephthalic acid，TPA）和 间 苯 二 甲 酸（isophthalic acid，IPA）为原料合成了一类二元配体羧酸功能化MOFs材料UiO-66-COOHs。与UiO-66-COOH相比，UiO-66-COOHs的亲水性能更强、结晶质量更佳，在2 l人血清胰酶消化液中可以富集到93种不同糖蛋白中的255种糖肽。采用亲水性基团修饰的方式仅适用于部分MOFs的改装，这种合成策略相对有限，创新性不足。MOFs拥有超高比表面积，能够为多肽吸附提供良好支撑，在其表面接枝大分子亲水性物质，不仅能够增加MOFs表面亲和位点的分布数量，还能协同静电作用、表面电荷分布等多种方式富集糖肽。Peng 等25将亲水性果糖-1,6-二磷酸分子（FDPn）修饰于有机骨架材料双金属锆基有机框架（dual-metal-centered zirconium-organic framework，DZMOF）表面。经磷酸化分子修饰的DZMOF能够动态屏蔽金属位置，调控表面电荷，弱化亲水性非糖肽物质与DZMOF之间的静电作用，增强亲水性糖肽的捕获信号。经MALDI-TOF-MS分析后，DZMOFFDPn可鉴定出人血浆的380个内源性N-糖肽以及180个N-糖肽位点。Wang等26利用戊二醛交联法将PAMAM连接于MIL-101（Cr）-NH2表面，合成了一类双亲水性 MOFs 材料 MIL-101（Cr）-NH2PAMAM。PAMAM 含有丰富的分支结构，其表面分布了大量亲水性结合位点，能够协同MIL-101（Cr）-NH2表面的氨基捕获目标糖肽。经人血清处理后，MIL-101（Cr）-NH2PAMAM能够富集到46种独特糖蛋白中的92种N-糖肽。半胱氨酸（Cys）是一类两性离子亲水化合物，常用于纳米材料表面功能化修饰。但是，Cys含有的亲水性基团太少，其富集能力相对有限。Li等27将含有丰富游离羧基和氨基的谷胱甘肽（GSH）与Cys以Au-S键的形式与金纳米团簇（AuGC）进行巧妙结合，负载于ZIF-8表面，合成了双功能化亲水性富集材料AuGC/ZIF-8。AuGC的表面加入Cys后，其空间位阻减小，能提供更多的糖肽结合位点，能促进AuGC/ZIF-8对糖肽的富集作用。AuGC/ZIF-8对50 g HepG2 细胞的蛋白胰酶消化物进行富集考察，经 MALDI-TOF-MS 分析，可鉴定出 1 711 个N-糖肽。磁性纳米粒是一类理化性质稳定，生物相容性良好，具有独特磁响应性能的纳米材料。经过磁性纳米粒修饰后的MOFs，在外加磁场的作用下，能够快速实现多肽分离，大大缩短目标物分离时间28-29。介孔材料拥有高度有序、尺寸可控的介孔结构，既能选择性吸附小分子肽，又能尺寸排除大分子蛋白质，是一类理想的富集纳米材料。MOFs与介孔材料复合后，比表面积扩大，表面能携带更多的修饰基团，可调控目标物的分子质量边界，拓宽MOFs的富集范围30-31。Saleem等32将氧化石墨烯（GO）覆盖于MOFs材料UiO-66-NH2表面，利用酰胺键将 GO-MOF 与苯硼酸（PBA）进行接枝，制备了