油莎豆基因组大小、倍性和系统发育分析_王会伟.pdf

河南农业科学，2023，52（1）：3441Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi：10.15933/ki.10043268.2023.01.004油莎豆基因组大小、倍性和系统发育分析王会伟1，朱世新2，张新友1，王艳1，杨铁钢1，张向歌1，王树峰1，李春鑫1（1.河南省农业科学院 经济作物研究所，河南 郑州 450002；2.郑州大学 生命科学院，河南 郑州 450001）摘要：为明确黄淮地区油莎豆主栽品种和特色种质资源的基因组特性及与其近缘类群的系统发育关系，利用流式细胞仪和基因组Survey分析对6个油莎豆材料基因组大小、倍性进行评估，并基于核糖体DNA的外转录间隔区（External transcribed spacer，ETS）和内转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）序列分析其与近缘类群间的系统发育关系。流式细胞仪分析结果表明，6 个油莎豆材料基因组在0.808 60.858 5 Gb，均值为0.826 4 Gb；基因组Survey分析结果表明，3种粒型油莎豆材料豫油莎2号、豫油莎 3号、YYS-4 的基因组大小、重复序列占比、GC 含量、杂合率分别为 0.697 9 Gb、81.02%、34.7%、0.28%，0.778 7 Gb、84.45%、36.4%、0.08%，0.790 6 Gb、83.75%、34.9%、0.19%；基因组Survey分析和花粉粒染色结果显示，3种粒型油莎豆材料均为三倍体。系统发育分析结果显示，6个油莎豆材料聚为油莎豆分支，该分支与香附子和头状穗莎草构成的分支形成亲缘关系较近的姐妹群，并与其余的C4植物（碎米莎草、长尖莎草等）构成C4植物分支。关键词：油莎豆；基因组大小；基因组倍性；系统发育中图分类号：S565.9文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）01-0034-08收稿日期：2022-06-07基金项目：国家重点研发计划项目（2019YFD1002600）；河南省重大科技专项（211100110100）；河南省农业科学院新兴学科发展专项（2022XK04）；河南省农业科学院自主创新项目（2022ZC13）作者简介：王会伟（1979-），男，河南辉县人，副研究员，博士，主要从事油莎豆种质利用和示范推广工作。E-mail：通信作者：李春鑫（1982-），男，河南滑县人，助理研究员，博士，主要从事油莎豆种质利用和育种研究。E-mail：Genome Size，Ploidy and Phylogeny of Cyperus esculentus L.WANG Huiwei1，ZHU Shixin2，ZHANG Xinyou1，WANG Yan1，YANG Tiegang1，ZHANG Xiangge1，WANG Shufeng1，LI Chunxin1（1.Industrial Crops Research Institute，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；2.School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）Abstract：In order to clarify the genome characteristics of the main varieties and characteristic germplasmof Cyperus esculentus L.in the Huang Huai region and the phylogenetic relationship between them andtheir related species，the genome size and ploidy of six C.esculentus L.materials were evaluated by flowcytometry and genome survey analysis，and the phylogenetic relationship between them and their relatedgroups was analyzed based on the sequences of the external transcribed spacer（ETS）and internaltranscribed spacer（ITS）of ribosomal DNA.The results of flow cytometry analysis showed that thegenomes of six C.esculentus L.materials were 0.808 60.858 5 Gb，with an average of 0.826 4 Gb；the results of genome survey analysis showed that the genome size，proportion of repetitive sequences，GCcontent and heterozygous ratio of the three tuber types of C.esculentus L.were 0.697 9 Gb，81.02%，34.7%and 0.28%for Yuyousha 2，0.778 7 Gb，84.45%，36.4%and 0.08%for Yuyousha 3，and0.790 6 Gb，83.75%，34.9%and 0.19%for YYS4，respectively；genome survey analysis and pollenstaining results showed that the three tuber types of C.esculentus L.were triploid.Phylogenetic analysis第 1 期showed that six C.esculentus L.were clustered into C.esculentus L.branch，this branch was closelyrelated to the branch composed of C.rotundus L.and C.glomeratus L.，they formed sister group，andformed C4plant branch with C.iria L.，C.glomeratus L.and C.cuspidatus H.B.K.Key words：Cyperus esculentus L.；Genome size；Genomic ploidy；Phylogeny我国是世界上植物油第一生产国和消费国，受限于国内产量，植物油供给对外依存度较高，已成为我国食用油供给安全的重大隐患。油莎豆（Cyperus esculentus L.）单产高、营养价值丰富、绿色健康、耐涝节水12，是助力植物油自主供给、发展健康饮食的理想作物3。目前，油莎豆已被科技部和农业农村部作为重要的新兴油源作物进行推广，2021年，农业农村部将其正式列入“十四五”全国种植业发展规划。油莎豆属于莎草科（Cyperaceae Juss.）、莎草属（Cyperus L.），该属全世界约有600种，分布于温带、亚热带和热带地区，我国有60多种4。油莎豆自20世纪50年代引入我国种植以来，由于种源多采用块茎营养繁殖，未经过现代育种技术改良，退化严重。目前，完善的油莎豆良种繁育技术和优异种质资源非常匮乏5。这主要是因为油莎豆研究基础薄弱，种质资源的遗传背景不明。因此，对油莎豆基因组大小、倍性和系统发育进行分析是油莎豆遗传改良和育种的基础。但是，目前此方面的研究非常少6。ZONNEVELD6在2019年利用流式细胞仪分析了荷兰油莎豆，发现其基因组约为0.669 Gb，并推测其为二倍体。通过测序来评估物种基因组大小和特性，是一种高效的方法。该方法已在研究基础薄弱的动植物遗传背景分析中得到广泛应用78，但目前尚没有利用该技术对油莎豆基因组进行研究的报道。为此，通过流式细胞仪和基因组Survey分析对黄淮地区油莎豆主栽品种和特色种质资源的基因组大小、倍性进行研究，并进行了系统发育分析，为明确我国油莎豆种质的遗传背景奠定基础。1材料和方法1.1试验材料供 试 油 莎 豆 为 豫 油 莎 1 号（C.esculentus L.Yuyousha 1，中圆粒）、豫油莎2号（C.esculentus L.Yuyousha 2，中圆粒）、豫油莎3号（C.esculentus L.Yuyousha 3，中长粒）、豫油莎5号（C.esculentus L.Yuyousha 5，中圆粒）、中油莎1号（C.esculentus L.Zhongyousha 1，中圆粒）、YYS-4（C.esculentus L.YYS-4，大粒），均由河南省农业科学院经济作物研究所油莎豆育种研究室提供。其中，豫油莎1号、豫油莎2号、豫油莎5号和中油莎1号为主栽品种，豫油莎3号和YYS-4为特色种质资源。1.2基因组大小、倍性分析1.2.1流式细胞仪分析取68叶期的6个油莎豆材料的新鲜叶片20 mg放在塑料培养皿的中心，添加 1 mL 预冷的细胞核裂解液（45 mmol/L MgCl26H2O、20 mmol/L MOPS、30 mmol/L 柠檬酸钠、10mmol/L Na2EDTA、20 mL/L-巯基乙醇、2%PVP-40、0.5%Triton X-100、0.1%Tween 20，pH 值7.0，-20 下保存，解冻后4 保存）到培养皿中，用刀片将叶片切碎，整个过程在冰袋上操作且保证叶片始终浸没在裂解液中，上下混合匀浆数次，将匀浆过滤到标记样品管中，加入DNA荧光铬的储备溶液，轻轻摇动。分析前在冰上孵育样品，偶尔摇晃。用流式细胞仪（美国BD Accuri C6）测量染色核的相对荧光。每个样品重复测定3次，变异系数控制在5%以内，以小麦（基因组为17 Gb）为参照。测定所得图像和数据由流式细胞仪自带软件进行处理分析。基因组大小=（样品荧光强度/参照荧光强度）参照基因组大小。1.2.2Survey分析1.2.2.1文库构建及测序取68叶期3种粒型油莎豆材料豫油莎2号（中圆粒）、豫油莎3号（中长粒）和YYS-4（大粒）的叶片，用改良的CTAB方法提取基因组DNA9。用Nano Drop 2000 分光光度计（Nano DropTechnologies，Wilmington，DE，USA）、Qubit 3.0 荧光计（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）和 0.8%琼脂糖凝胶电泳来检测其浓度和质量。然后3个材料各取1 g DNA采用MGI DNA文库通用试剂盒（诺唯赞，南京）构建文库，对每个样本添加index。文库构建完成后，使用Qubit 3.0荧光计 和 Bioanalyzer 2100 系 统（Agilent Technologies，CA，USA）测定文库中样品的浓度和片段大小分布，以确定合适的上机pooling方案。文库检测合格后，在MGI-SEQ 2000平台上进行测序，具体测序服务由武汉菲沙基因信息有限公司提供。1.2.2.2Survey 分析在二代测序数据下机后，利王会伟等：油莎豆基因组大小、倍性和系统发育分析35河南农业科学第 52 卷用HTQC（v1.92.310）软件对原始数据进行过滤，过滤标准如下：去除接头序列和PCR扩增等原因引起的冗余序列；去除单端测序读长中的一端含有的N含量占比超过10%的测序片段；去除测序片段中的一端含有的低质量碱基数（5）占比超过50%的片段，得到高质量测序数据。参照LIU等10的方法，通过 GCE（Genome chara