右美托咪定调控Nrf2_H...细胞氧化应激损伤的作用研究_钱厚霖.pdf

中国现代医学杂志China Journal of Modern MedicineVol.33 No.7Apr.2023第 33 卷 第 7 期2023 年 4 月右美托咪定调控Nrf2/HO-1通路对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用研究*钱厚霖1，周述芝2，毕小波1，龙翔1（1.西南医科大学附属医院 麻醉科，四川 泸州 646000；2.雅安市人民医院 麻醉科，四川 雅安 625000）摘要：目的探讨右美托咪定调控核因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶1（HO-1）通路对过氧化氢（H2O2）诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用。方法体外培养大鼠H9C2心肌细胞，设置对照组、H2O2组、1 mol右美托咪定+H2O2组、5 mol右美托咪定+H2O2组、10 mol右美托咪定+H2O2组。CCK-8法检测各组H9C2细胞增殖情况；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组H9C2细胞丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组H9C2细胞Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量；Western blotting检测各组H9C2细胞Nrf2、HO-1蛋白相对表达量。结果与对照组比较，H2O2组H9C2细胞存活率、SOD水平、Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白相对表达量降低，MDA水平升高（P 0.05）；与H2O2组比较，1 mol右美托咪定+H2O2组、5 mol右美托咪定+H2O2组、10 mol右美托咪定+H2O2组H9C2细胞存活率、SOD水平、Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白相对表达量均升高，MDA水平降低（P 0.05），且呈右美托咪定浓度依赖性。结论右美托咪定可能通过激活Nrf2/HO-1通路，发挥对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。关键词：缺血性心脏病；心肌细胞；氧化应激损伤；右美托咪定；核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1通路中图分类号：R542.2；R965.1文献标识码：AEffect of dexmedetomidine regulating Nrf2/HO-1 pathway on H2O2-induced oxidative stress injury in cardiomyocytes*Qian Hou-lin1,Zhou Shu-zhi2,Bi Xiao-bo1,Long Xiang1(1.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China;2.Department of Anesthesiology,Yaan Peoples Hospital,Yaan,Sichuan 625000,China)Abstract:Objective To investigate the effect of dexmedetomidine on hydrogen peroxide(H2O2)-induced oxidative stress injury of cardiomyocytes by regulating the nuclear factor erythroid 2 related factor 2(Nrf2)/heme oxygenase-1(HO-1)pathway.Methods Rat H9C2 cardiomyocytes were cultured in vitro,and the control group,H2O2 group,1 mol dexmedetomidine+H2O2 group,5 mol dexmedetomidine+H2O2 group,10 mol dexmedetomidine+H2O2 group were set up.The proliferation of H9C2 cells was detected by CCK-8 method;the levels of malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)in H9C2 cell culture medium were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);the expressions of Nrf2,HO-1 mRNAs in H9C2 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR(qRT-PCR);and the expressions of Nrf2,HO-1 proteins in H9C2 cells were detected by Western blotting.Results Compared with the control group,the H9C2 cell survival rate,SOD level,Nrf2 mRNA,HO-1 mRNA,HO-1 protein expression levels in H2O group were decreased,and MDA level 实验研究 论著DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2023.07.007文章编号：1005-8982（2023）07-0040-06收稿日期：2023-01-19*基金项目：四川省医学（青年创新）科研课题项目（No：S21033）40第 7 期钱厚霖，等：右美托咪定调控Nrf2/HO-1通路对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用研究were increased(P 0.05);compared with H2O group,the H9C2 cell survival rate,SOD level,Nrf2,HO-1 mRNA and protein expression levels in 1,5,10 mol dexmedetomidine+H2O2 groups were increased,and MDA level were decreased(P 0.05);and dexmedetomidine was concentration-dependent.Conclusion Dexmedetomidine can protect cardiomyocytes from H2O2-induced oxidative stress injury by activating Nrf2/HO-1 pathway.Keywords:ischemic heart disease;cardiomyocytes;oxidative stress injury;dexmedetomidine;nuclear factor erythroid 2 related factor 2/heme oxygenase-1 pathway缺血性心脏病指由于冠状循环改变、冠状动脉血流与心肌需求间不平衡而导致心肌发生损伤的心脏病1。临床上主要采用再灌注治疗缺血性心脏病，但血流再灌后会加重心肌组织损伤，即发生 心 肌 缺 血/再 灌 注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤2。氧化应激是再灌注损伤中最重要的病理机制之一，它通过多种途径引起心肌细胞凋亡、自噬、炎症等损伤，从而引起不可逆的心肌细胞损伤和心功能障碍3。研究报道，心肌细胞氧化应激损伤涉及到多个生物学过程，如核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2）/血红素加氧酶 1（heme oxygenase-1,HO-1）通路的过度激活4。Nrf2/HO-1 通路是细胞内参与抗氧化应激的重要通路，氧化应激过度激活后，氧自由基增多，刺激Nrf2 表达上调，并识别 HO-1 的抗氧化反应元件，并启动 HO-1 表达，发挥抗氧化作用5。右美托咪定是一种2肾上腺素能受体激动剂，在麻醉、重症监护治疗中发挥镇静、镇痛作用，近年来研究发现，其对I/R过程具有保护作用6-7。此外，对Nrf2/HO-1 通路的激活是右美托咪定发挥抗氧化作用的重要机制8。本研究采用过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）诱导心肌细胞氧化应激损伤，探讨右美托咪定对此过程的影响，并分析其潜在机制。1 材料与方法1.1细胞、试剂与仪器大鼠 H9C2 细胞（美国模式培养物集存库，货号：FB0673）。DMEM 培养基（德国 Merck KGaA 公司，货号：KL-P0032），右美托咪定注射液（江苏恩华药业股份有限公司），CCK-8 试剂（日本同仁化学研究所，货号：CK-04），丙二醛（MDA）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉亚科因生物科技有限公司，货号：ABB-KTE71091-48T），超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 试剂盒（英国 Abbexa 公司，货号：abx585004），兔一抗 Nrf2、HO-1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（英国 Abcam 公司，货号：ab89443、ab13243、ab181602），山羊抗兔二抗（美国 Santa 公司，货号：0295G-HRP）。ABI 7500 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）仪（美国 Applied Biosystems公司），MODEL550 酶标仪、ChemiDocXRS 化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。1.2方法1.2.1 细胞培养与分组 H9C2细胞在含有10%胎牛血清和1%青/链霉素的DMEM培养基中于37、5%二氧化碳的培养箱中培养。待细胞生长到对数生长期后，将H9C2细胞接种于6孔培养板中（1105个/孔），分为对照组、H2O2组（200 mol/L 的H2O2处理 24 h）、1 mol/L 右美托咪定+H2O2组（用终浓度为 1 mol/L 右美托咪定的 DMEM 培养基预处理 30 min 后，用 200 mol/L 的 H2O2处理 24 h）、5 mol 右美托咪定+H2O2组（用终浓度为 5 mol/L右美托咪定的 DMEM 培养基预处理 30 min 后，用200 mol/L的H2O2处理24 h）、10 mol右美托咪定+H2O2组（用终浓度为10 mol/L右美托咪定的DMEM培养基预处理30 min后，用200 mol/L的H2O2处理24 h）。对照组用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基培养。每组设6个复孔。1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 培养 48 h 后，将各组 H9C2 细胞用 CCK-8 试剂孵育 2 h，酶标仪检测光密度（OD）值，细胞存活率（%）=OD处理组/OD对照组100%。1.2.3 ELISA检测细胞MDA、SOD水平 收集各组细胞培养液，采用 ELISA 法检测 MDA、SOD 水平，酶标仪检测各孔 OD 值，根据标准品绘制标准曲线，并计算MDA、SOD水平。1.2.4 qRT-PCR 检测细胞 Nrf2、HO-1 mRNA 表达 用 TRIzol 试剂提取细胞总 RNA，逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，然后进行扩增。反应体系：正反向引物各 0.5 L，10cDNA 模板 1 L，2SYBR mix 10 L，ddH2O 8 L。扩 增 条 件：41中国现代医学杂志第 33 卷 95 预变性 5 min，95 变性 15 s，55 退火 30 s，60 延伸 1 min，40 个循环。GAPDH 为内参基因。Nrf2 正向引物：5-CGGTATGCAACAGGACATTG-3，反向引物：5-TCTGTCAGTTTGGCTTCTGG-3，引物长度：119 bp；HO-1正向引物：5-AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC-3，反向引物：5-AAAGCCCT