应用核糖体展示技术筛选抗人p53单链抗体的效果_陈荫楠.pdf

1第35卷 第1期2023年VOL.35NO.12023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGEDOI:10.3969/j.issn.1008-4118.2023.01.001*应用核糖体展示技术筛选抗人 p53 单链抗体的效果陈荫楠，罗婉妹，罗彩林，郑晨娜，郭娜燕（泉州医学高等专科学校，福建 泉州 362000）摘要：目的 运用核糖体展示技术筛选抗人 p53 单链抗体，并进行初步分析。方法诱导表达 p53 蛋白，用其免疫小鼠。提取免疫小鼠脾脏组织的总 RNA，通过反转录 PCR 和重叠延伸 PCR 分别扩增抗体重链可变区基因 VH-Linker 和轻链可变区基因 VL-Linker，并合成 VH-linker-VL 型单链抗体基因。TNT T7 Quick for PCR DNA 试剂盒对单链抗体基因进行体外转录与翻译，以 p53 蛋白为靶标，经过 5 轮筛选富集 ScFv 基因。将获取单链抗体片段进行原核表达后，采用 ELISA 法和细胞免疫学法检测。结果 成功构建抗 p53 单链抗体库，并筛选出 p53 蛋白具有较强结合活性的单链抗体株 p53-scFv1、p53-scFv2 和 p53-scFv3，可用以检测细胞中的 p53 蛋白。结论 利用核糖体展示技术获得亲和力较好的抗人 p53 单链抗体，可为 p53 抗体的制备提供新思路。关键词：p53 蛋白；单链抗体；核糖体中图分类号：Q753 文献标识码：A 文章编号：1008-4118（2023）01-0001-06Screening of anti-human p53 single chain antibody by ribosome display technology CHEN Yinnan,LUO Wanmei,LUO Cailin,ZHENG Chenna,GUONayan（Quanzhou Medical College,Quanzhou 362000,Fujian）Abstract:Objective To screen and analyze anti-human p53 single chain antibody by ribosome display technology.Methods Immunemicewere induced expression of p53 protein.Total RNA was extracted from spleen tissues of immunized mice.The VH-Linker and VL-Linker genes were amplified by reverse transcription PCR and overlapping extension PCR respectively,and VH-Linker-VL type SCFV genes were synthesized.TNT T7 Quick for PCR DNA kit was used in transcription and translation of single chain antibody gene,with p53 protein as the target SCFV gene was enriched after five rounds of screening.After prokaryotic expression,the SCFV fragments were detected by ELISA and cellular immunoassay.Results Anti-p53 single chain antibody library was successfully constructed.The single chain antibody strains p53-scFv1,p53-scFv2 and p53-scFv3 with strong binding activity were screened out to detect p53 protein in cells.Conclusion The ribosome display technology was used to obtain anti-human p53 SCFV with good affinity,which can provide a new idea for the preparation of p53 antibody.Key words:p53 protein;Single-chain antibody;Ribosome基金项目：泉州医学高等专科学校科研项目（XJK1617B）p53 蛋白作为体内重要的转录因子，与机体的新陈代谢、免疫应答、DNA 的修复、肿瘤的发生等代谢过程密切相关。p53蛋白由于半衰期较短（约20 min），一般胞内浓度处于较低水平。野生型的p53 基因有抑癌作用，被称为基因卫士1。然而，当 p53 基因发生突变后，不仅失去了抑癌作用，而且促进了肿瘤细胞的形成，提高了对抗癌药的耐药性2。突变型的 p53 基因半衰期延长，在细胞内的含量会增加，可通过免疫学方法检测出来。检测肿瘤组织中p53蛋白的表达对早期诊断筛查、治疗方案及预后判断都有重要的参考意义3-4，因此，制备高效且便宜的 p53 抗体对 p53 蛋白的高2 第35卷 第1期2023年VOL.35NO.12023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGE效检测及进一步研究具有重要的作用。随着基因重组技术的不断发展，抗体制备从传统的多克隆抗体、单克隆抗体发展到第三代基因工程抗体5-6。单链抗体作为新型的基因工程抗体，由含抗体重链可变区和轻链可变区组成，分子量小，细胞穿透能力强，无需经杂交瘤技术便可获得抗体7。核糖体抗体库技术通过 PCR 技术直接构建抗体基因文库，在体外进行转录和翻译，将核糖体表面表达的抗体与基因型进行偶联，最后用相应的目的蛋白筛选抗体8-9。该技术无需转化细胞，库容量大、操作简便10。本研究应用核糖体展示技术制备并筛选抗 p53 单链抗体，全程操作均在体外操作，过程简单、筛选效率高，便于大批量生产，为 p53 抗体的制备提供新思路。1材料和方法1.1 材料 p53蛋白实验室保存；E.coli DH5、E.coli BL21（DE3）、E.coli Rosetta（DE3）、pET-32a（+）vector、pET-27b（+）vector 实验室保存；各种引物由上海生工生物有限公司合成；各种 DNA 限制性内切酶购自日本 Takara 公司；HRP 标记的抗 His-tag 抗体购自美国 Abcam 公司；First Strand cDNA Synthesis Kit 购自美 Thermo Fisher Scientific公司；山羊抗小鼠 IgG/FITC 标记购自北京中杉金桥生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 重组蛋白 p53 的分离纯化 将含有重组质粒pET-27b（+）-p53 的 E.coli DH5 菌株涂布于带有相应抗性的平板，培养过夜后，选取单克隆接种到含卡那抗性的 LB 液体培养基中，于 37下过夜培养至对数生长期，提取质粒11。将 提 取 的 pET-27b（+）-p53 质 粒 分 别 用PCR、双酶切的方法进行验证，将验证正确的重组质粒转化 E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞中，接种于含卡那霉素和氯霉素抗性的 LB 固体平板筛选转化子。选取的转化子接种于含抗性的液体培养基中，37、200 rpm 振荡培养至 OD600值达 0.6 时，加入 0.2 mM IPTG 诱导培养 3 h，同时以不加 IPTG诱导作为对照组。4、4000 rpm 离心 5 min 收集菌体，超声破碎后，分离出破碎菌液的上清和沉淀，SDS-PAGE 检测分析 p53 蛋白的表达。1.2.2 构建抗 p53 单链抗体文库 将获得的 p53 蛋白结合 Freund 佐剂对小鼠进行注射免疫，共免疫3 次，期间采集尾血测小鼠血清效价。达到要求后，从小鼠脾脏提取总 RNA，反转录成 cDNA，利用保守区引物扩增抗体的重、轻链12。具体引物序列如表 1 所示。表 1PCR 扩增引物基因引物序列（5 3）VHVH/backGCAGCTAATACGACTCACTATAGGAAGAACAGACCACCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG VH-linker/forGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTVLVL-linker/backTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCACk/forGCTCTAGAACACTCATTCCTGTTGGAGCTPCR 反应条件：95预变性 2 min，95变性30 s，58退火 30 s，72延伸 50 s，共 30 个循环，最后 72延伸 5 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后回收。通 过 重 叠 延 伸 PCR（SOE-PCR）将 获 得的 VH-linker 和 VL-linker 基因片段组装成 VH-linker-VL 单链抗体库。第一轮为无引物 PCR，按顺序加入下列试剂：2Ecotaq PCR supermix 20L、VH-linker 和 VL-linker 各 4L、ddH2O 12L，共 40L。扩增条件为：95预变性 2 min；95变性 30 s，52退火 30 s，72延伸 1 min，共 10 个循环。第二轮 PCR 反应体系为：2Ecotaq PCR supermix 5L、VH/back 和 Ck/for各 2L、ddH2O 1L，扩增条件设为：95预变3第35卷 第1期2023年VOL.35NO.12023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGE性 2 min；95变性 30 s，58退火 30 s，72延伸 1 min，共 25 个循环。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后回收。1.2.3 核糖体展示技术翻译与筛选 单链抗体库在无 RNA 酶的 4环境中操作，于微量离心管中按顺序加入下列试剂：TNT T7 PCR Quick Master Mix 40L、1 mM Methionine 1L、DNA 模 板 8L、ddH2O 1L，共 50L。于 30水浴条件下反应 90 min。体外筛选步骤13-14：取 100L 纯化后的 p53蛋白包被于 96 孔板中，4反应过夜；次日，用PBS 缓冲液洗涤 3 次，加入 5%脱脂奶于 37封闭 1 h；再用 PBSM 缓冲液（含 5 mmol/L MgCl2）洗涤 3 次；将翻译混合物按每孔 50L 转至包被p53 蛋白的孔板中，置于冰上反应 2 h；PBSMT 缓冲液（含 0.5 mL/L Tween-20）洗涤 3 次；PBSM缓冲液洗涤 2 次；加入含 20 mM EDTA 的 1PBS缓冲液，在冰上放置10 min进行解离后吸取上清。以上清 mRNA 为模板，进行 RT-PCR，PCR 产物用以重复下一轮筛选。1.2.4 抗 p53 ScFv 的克隆和表达 将最后一轮筛选获得的基因产物两端插入 EcoR I 和 Xho I 酶切位点，双酶切后与经同样双酶切的表达载体 pET-32a（+）通过 T4 连接酶连接，重组质粒 pET-32a（+）-scFv 转化大肠杆菌 Rosetta2TM（DE3）感受态细胞中，用抗性平板（含 100g/mL 氨苄青霉素、25g/mL 氯霉素）筛选转化子。从中随机选取 100 个阳性克隆子，参照 1.2.1 进行小量诱导表达 p53 单