中华猕猴桃果仁非饱和脂肪酸...胶原蛋白合成抗大鼠肺纤维化_刘理静.pdf

论论著著文文章章编编号号：（）中中华华猕猕猴猴桃桃果果仁仁非非饱饱和和脂脂肪肪酸酸通通过过下下调调 抑抑制制胶胶原原蛋蛋白白合合成成抗抗大大鼠鼠肺肺纤纤维维化化刘刘理理静静，贺贺立立洋洋，魏魏文文婕婕，周周美美玲玲，贺贺彬彬，贺贺兼兼斌斌（长长沙沙民民政政职职业业技技术术学学院院医医学学院院，湖湖南南 长长沙沙 ；湖湖南南医医药药学学院院护护理理学学院院，湖湖南南 怀怀化化 ；怀怀化化市市第第一一人人民民医医院院呼呼吸吸与与危危重重症症医医学学科科，湖湖南南 怀怀化化 ）收收稿稿日日期期：；接接受受日日期期：基基金金项项目目：湖湖南南省省自自然然科科学学基基金金资资助助项项目目（）；怀怀化化市市科科技技计计划划资资助助项项目目（）；湖湖南南省省卫卫生生与与健健康康委委员员会会资资助助科科研研项项目目（）作作者者简简介介：刘刘理理静静（），男男，湖湖南南溆溆浦浦人人，副副主主任任医医师师，医医学学硕硕士士 ：；：通通讯讯作作者者，贺贺兼兼斌斌，：摘摘 要要 目目的的 观观察察结结缔缔组组织织生生长长因因子子（）及及胶胶原原蛋蛋白白合合成成在在果果王王素素（中中华华猕猕猴猴桃桃果果仁仁非非饱饱和和脂脂肪肪酸酸）抗抗大大鼠鼠肺肺纤纤维维化化（）中中的的作作用用。方方法法 雄雄性性 大大鼠鼠，随随机机分分为为对对照照组组、模模型型组组、（、）果果王王素素处处理理组组和和 醋醋酸酸泼泼尼尼松松组组，每每组组 只只。对对照照组组大大鼠鼠以以 氯氯化化钠钠溶溶液液气气管管内内注注射射，后后 组组大大鼠鼠则则气气管管内内注注射射博博莱莱霉霉素素 构构建建 模模型型，建建模模后后次次日日，后后 组组大大鼠鼠分分别别以以（、）果果王王素素和和 醋醋酸酸泼泼尼尼松松灌灌胃胃，而而前前 组组予予 氯氯化化钠钠溶溶液液灌灌胃胃，均均每每天天 次次。处处理理后后第第 天天，处处死死大大鼠鼠取取肺肺组组织织，和和 染染色色评评价价 病病变变程程度度，测测定定羟羟脯脯氨氨酸酸（）含含量量，实实时时荧荧光光定定量量 检检测测 、平平滑滑肌肌肌肌动动蛋蛋白白（）表表达达，法法测测定定 、型型胶胶原原蛋蛋白白（）、的的蛋蛋白白水水平平，免免疫疫组组织织化化学学染染色色分分析析 表表达达情情况况。结结果果 与与模模型型组组相相比比，（、）果果王王素素处处理理组组和和 醋醋酸酸泼泼尼尼松松组组肺肺泡泡炎炎及及 程程度度显显著著减减轻轻，肺肺组组织织 含含量量减减少少，、与与蛋蛋白白表表达达下下调调，、蛋蛋白白水水平平降降低低。上上述述指指标标的的改改变变在在（、）果果王王素素处处理理组组之之间间有有剂剂量量依依赖赖性性。此此外外，（、）果果王王素素处处理理组组上上述述指指标标较较 醋醋酸酸泼泼尼尼松松组组升升高高，而而 果果王王素素处处理理组组与与后后者者相相比比差差异异不不明明显显。结结论论 果果王王素素下下调调肺肺组组织织 表表达达，降降低低 水水平平，进进而而减减少少 、合合成成，发发挥挥抗抗 作作用用。关关键键词词 果果王王素素（中中华华猕猕猴猴桃桃果果仁仁非非饱饱和和脂脂肪肪酸酸）；结结缔缔组组织织生生长长因因子子；肺肺纤纤维维化化；平平滑滑肌肌肌肌动动蛋蛋白白（）；型型胶胶原原蛋蛋白白（）；型型胶胶原原蛋蛋白白（）中中图图分分类类号号 ，文文献献标标志志码码 （），；，；，：（）（）（），（，），（）（）细胞与分子免疫学杂志（），（）DOI:10.13423/ki.cjcmi.009479 ，（），（，），（，），（）；（）；（）；（）肺肺纤纤维维化化（，）是是以以过过量量的的胶胶原原蛋蛋白白如如 型型胶胶原原蛋蛋白白（，）和和 积积蓄蓄于于肺肺间间质质内内为为特特征征的的一一种种致致命命性性肺肺疾疾病病，起起病病后后病病情情迅迅速速进进展展，患患者者最最终终因因肺肺功功能能损损毁毁死死于于呼呼吸吸衰衰竭竭 ，至至今今缺缺乏乏针针对对性性的的治治疗疗手手段段。随随着着现现代代医医学学研研究究深深入入，以以 驱驱动动基基因因为为切切入入点点探探索索分分子子靶靶向向治治疗疗新新药药为为 治治疗疗带带来来了了新新途途径径。结结缔缔组组织织生生长长因因子子（，）为为一一种种分分泌泌性性蛋蛋白白，可可诱诱导导细细胞胞外外基基质质（，）大大量量合合成成，是是组组织织重重塑塑和和纤纤维维化化形形成成的的中中心心介介质质，作作为为促促纤纤维维化化因因子子在在 进进程程中中发发挥挥关关键键调调节节作作用用 。因因此此，积积极极寻寻找找调调控控 过过量量分分泌泌的的靶靶向向治治疗疗新新药药对对于于改改善善 预预后后具具有有重重要要价价值值。果果王王素素（）是是从从猕猕猴猴桃桃的的果果仁仁中中经经临临界界 萃萃取取 法法 提提 取取 的的 非非 饱饱 和和 脂脂 肪肪 酸酸，亚亚 麻麻 酸酸（，）为为其其主主要要药药效效成成分分，又又称称为为中中华华猕猕猴猴桃桃果果仁仁油油非非饱饱和和脂脂肪肪酸酸（），具具有有抑抑制制炎炎症症、保保护护细细胞胞活活性性、抗抗氧氧化化应应激激和和抗抗癌癌等等药药理理活活性性 。本本课课题题组组前前期期工工作作发发现现，果果王王素素可可通通过过增增强强大大鼠鼠抗抗氧氧化化损损伤伤能能力力而而抑抑制制 。然然而而，果果王王素素抗抗 作作用用机机制制仍仍不不完完全全明明了了，是是否否通通过过调调控控 表表达达抑抑制制胶胶原原蛋蛋白白合合成成而而起起作作用用，尚尚未未见见报报道道。故故本本研研究究通通过过观观察察不不同同剂剂量量果果王王素素处处理理对对博博莱莱霉霉素素诱诱导导的的 大大鼠鼠肺肺组组织织病病变变、羟羟脯脯氨氨酸酸（，）含含量量及及 、平平滑滑肌肌肌肌动动蛋蛋白白（，）、和和 表表达达的的影影响响，进进一一步步阐阐明明果果王王素素抗抗 的的相相关关分分子子机机制制，旨旨在在为为其其应应用用于于防防治治 提提供供新新的的药药理理学学依依据据。材材料料和和方方法法 材材料料雄雄性性健健康康 周周龄龄 大大鼠鼠 只只，体体质质量量（），来来自自南南华华大大学学实实验验动动物物部部（许许可可证证号号：湘湘 ）。果果王王素素（中中华华猕猕猴猴桃桃果果仁仁非非饱饱和和脂脂肪肪酸酸含含量量 ）呈呈黄黄色色油油性性液液体体，购购自自湘湘西西老老爹爹生生物物有有限限公公司司；博博莱莱霉霉素素 购购自自天天津津太太河河制制药药有有限限公公司司；醋醋酸酸泼泼尼尼松松片片购购自自山山东东鲁鲁抗抗医医药药集集团团有有限限公公司司；兔兔抗抗大大鼠鼠 抗抗体体、兔兔抗抗大大鼠鼠 抗抗体体、兔兔抗抗大大鼠鼠 抗抗体体、兔兔抗抗大大鼠鼠 抗抗体体、兔兔抗抗大大鼠鼠 肌肌动动蛋蛋白白（）多多克克隆隆抗抗体体购购自自 公公司司；二二辛辛可可宁宁酸酸（，）法法蛋蛋白白质质定定量量试试剂剂盒盒、辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（，）标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 和和逆逆转转录录试试剂剂盒盒购购自自 公公司司；二二 氨氨 基基 联联 苯苯 胺胺（，）显显色色剂剂购购自自福福建建迈迈新新生生物物技技术术公公司司；检检测测试试剂剂盒盒购购自自南南京京建建成成生生物物工工程程研研究究所所。方方法法 模模型型的的制制备备和和分分组组处处理理 将将雄雄性性 大大鼠鼠 只只，随随机机分分为为对对照照组组、模模型型组组、果果王王素素处处理理组组、果果王王素素处处理理组组、果果王王素素处处理理组组和和 醋醋酸酸泼泼尼尼松松组组（参参照照相相关关文文献献和和前前期期工工作作确确定定药药物物处处理理剂剂量量 ），各各组组 只只。依依据据文文献献报报道道的的方方法法 建建模模，即即先先用用 的的 戊戊巴巴比比妥妥钠钠经经腹腹腔腔注注射射，待待大大鼠鼠完完全全麻麻醉醉后后，将将颈颈正正中中切切开开使使气气管管充充分分暴暴露露，再再向向后后 组组大大鼠鼠气气管管内内注注入入溶溶解解了了 博博莱莱霉霉素素 的的 氯氯化化钠钠溶溶液液 ，构构建建 模模型型。而而对对照照组组则则用用 氯氯化化钠钠溶溶液液替替代代博博莱莱霉霉素素 。建建模模后后，次次日日即即开开始始药药物物处处理理，果果王王素素处处理理组组分分别别予予（、）果果王王素素（用用 氯氯化化钠钠溶溶液液稀稀释释，总总体体积积 ）灌灌细胞与分子免疫学杂志（），（）胃胃，醋醋酸酸泼泼尼尼松松组组予予以以 醋醋酸酸泼泼尼尼松松（溶溶解解于于 氯氯化化钠钠溶溶液液，总总体体积积 ）灌灌胃胃，而而前前 组组则则用用 氯氯化化钠钠溶溶液液 灌灌胃胃，每每天天均均 次次。全全部部大大鼠鼠于于用用药药后后第第 天天处处死死，剖剖胸胸并并截截取取左左肺肺组组织织，立立即即放放入入液液氮氮中中冻冻存存，用用于于 含含量量和和 、表表达达检检测测。然然后后用用 中中性性甲甲醛醛溶溶液液通通过过主主支支气气管管向向右右肺肺内内注注入入，充充分分展展开开胸胸膜膜后后，迅迅速速固固定定于于 中中性性甲甲醛醛溶溶液液中中 以以上上，用用于于肺肺组组织织病病理理学学检检查查。染染色色和和 染染色色观观察察肺肺组组织织病病变变情情况况将将石石蜡蜡包包埋埋后后的的右右肺肺组组织织行行 厚厚切切片片，再再常常规规 染染色色和和 染染色色，在在光光镜镜下下使使用用 图图像像分分析析软软件件评评价价肺肺组组织织肺肺泡泡炎炎症症（染染色色）和和 病病变变程程度度（染染色色），评评分分方方法法依依据据文文献献 ：无无肺肺泡泡炎炎和和 ，计计 分分；肺肺泡泡炎炎与与 的的面面积积未未超超出出 ，计计 分分；肺肺泡泡炎炎与与 的的面面积积超超出出 ，但但未未超超出出 ，计计 分分；肺肺泡泡炎炎与与 的的面面积积超超出出 ，计计 分分。采采用用试试剂剂盒盒检检测测肺肺组组织织 含含量量 用用无无菌菌眼眼科科剪剪充充分分剪剪碎碎左左肺肺组组织织，然然后后以以碱碱水水解解液液进进行行匀匀浆浆，离离心心并并提提取取上上清清液液，利利用用检检测测试试剂剂盒盒提提供供的的方方法法，对对上上清清液液中中 含含量量进进行行测测定定。实实时时荧荧光光定定量量 检检测测肺肺组组织织 、水水平平 取取适适量量左左肺肺组组织织，利利用用 试试剂剂提提取取样样本本中中总总 ，再再将将 按按照照逆逆转转录录试试剂剂盒盒说说明明书书的的操操作作步步骤骤反反转转录录为为 ，进进行行 扩扩增增。上上游游引引物物为为 ，下下 游游 引引 物物 为为 ；上上 游游 引引 物物 为为 ，下下游游引引物物为为 ；上上游游引引物物为为 ，下下游游引引物物为为 。反反应应体体系系为为：、上上游游引引物物（）、下下游游引引物物（）、，总总体体积积 。反反应应程程序序：预预变变性性 ，（变变性性 ，退退火火 ，延延伸伸 ）个个循循环环。在在实实时时荧荧光光定定量量 仪仪上上，使使用用 操操作作方方法法行行 反反应应。通通过过 法法，以以 为为内内参参照照定定量量 、表表达达量量。法法检检测测肺肺组组织织 、和和 蛋蛋白白水水平平 制制备备 ，取取适适量量左左肺肺组组织织，用用 裂裂解解液液提提取取样样本本中中蛋蛋白白质质；法法定定量量并并统统一一上上样样量量，凝凝胶胶电电泳泳 ，转转 膜膜。脱脱脂脂牛牛奶奶室室温温下下封封闭闭，分分别别滴滴加加兔兔抗抗大大鼠鼠 抗抗体体（）、兔兔抗抗大大鼠鼠 抗抗体体（）、兔兔抗抗大大鼠鼠 抗抗体体（）、兔兔抗抗大大鼠鼠 抗抗 体体（）和和 兔兔 抗抗 大大 鼠鼠 抗抗 体体（），孵孵育育过过夜夜；洗洗涤涤后后，加加入入 标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 （），反反应应 ；再再次次冲冲洗洗 膜膜，化化学学发发光光法法显显影影并并于于暗暗室室曝曝光光，通通过过凝凝胶胶图图像像分分析析系系统统（软软件件）对对所所得得胶胶片片进进行行扫扫描描后后，得得出出 、蛋蛋白白相相对对表表达达量量。免免疫疫组组织织化化学学染染色色法法检检测测肺肺组组织织 蛋蛋白白表表达达 依依据据链链霉霉亲亲和和素素 过过氧氧化化物物酶酶（，）试试剂剂盒盒提提供供的的方方法法，对对肺肺组组织织切切片片进进行行检检测测。将将切切片片进进行行脱脱