长链非编码RNA参与七氟烷诱导的海马神经元凋亡_刘玉明.pdf

第 卷第期 年 月福建医科大学学报 长链非编码 参与七氟烷诱导的海马神经元凋亡刘玉明，赖静兰，姚志雄摘要：目的探讨长链非编码（）与七氟烷麻醉副作用的关联。方法采用小鼠模型分析七氟烷对海马锥体的影响，采用生物信息学方法分析 数据库中七氟烷处理的小鼠相关的 表达谱数据，筛选可能与七氟烷麻醉过程相关的 ，并使用 对 进行验证。结果七氟烷处理可导致小鼠海马锥体神经元结构异常，增加细胞凋亡。基因芯片分析显示，在小鼠（）中，七氟烷处理后 个 出现差异表达。验证发现，经七氟烷处理后，小鼠海马组织 和 的表达水平提高。结论不适量的七氟烷处理可引起海马锥体神经元结构改变和细胞凋亡，可能参与了该病理性作用。关键词：七氟烷；海马锥体神经元；表达谱芯片；长链非编码；凋亡文献标志码：文章编号：（）收稿日期：资助项目：福建省自然科学基金项目（）作者单位：福建医科大学 孟超肝胆医院，福州 麻醉科；感染科作者简介：刘玉明，男，主治医师通信作者：姚志雄 ：七氟烷首先由 发现，于 年由 合成，年完成三期临床试验，年首先由日本的药监部门批准临床使用。近年来，七氟烷被誉为吸入麻醉的里程碑式药物，在儿童和剖宫产孕妇的全麻诱导及其维持中具有显著优点。与氯胺酮基础麻醉下给予小剂量阿片类药物和催眠镇静药物相比，七氟烷麻醉的优点是诱导期患者较平静，术中血流动力学较平稳，肌肉松弛药用量小，术后苏醒快，且意识完全清醒，但诱导期和恢复期的躁动是需克服的问题。此外，动物实验表明，如果七氟烷的剂量过高，动物会出现神经毒性致短暂的认知障碍。但高剂量七氟烷麻醉副作用的机制仍然未知，探索其机制或作用靶点无疑会对改善七氟烷麻醉效果提供新的思路。长 链 非 编 码 （，）是一类由 聚合酶或 聚合酶转录、长度 个核苷酸的非编码 ，位于细胞核内或细胞质中，其表达具有组织特异性和时空特 异 性。近 年 来，随 着 测 序 技 术 的 发 展，在肿瘤发生发展、神经科学和个体发育等许多生物学领域发挥着重要作用，是人类基因组的重要调控分子。文献 表明，和麻醉药物的效果及副作用有密切关系。可能介导了七氟烷麻醉对神经系统的损伤。近年来，关于 与神经系统联系的研究越来越多，但目前对 的了解还存在很多空白，而且 物种间保守性较低，需要跨物种分析 功能的普适性。因此，本研究通过 软件包分析了七氟烷处理的小鼠海马组织 表达谱芯片数据，并进行验证。对象与方法 动物与试剂 雌性小鼠购于北京维通利华 许可证：（京）；品系代码：；周，体质量约 ，无特殊病原菌条件、的光照周期下进行标准饲养，周龄时进行实验。七氟烷（批号：，上海恒瑞医药有限公司）；提取试剂盒（，北京全式金 生 物 技 术 股 份 有 限 公 司）；反 转 录 试 剂（，大连宝日医生物技术有限公司）；染料法 试剂（，北京康润诚业生物科技有限公司）。方法 七氟烷处理 雌性小鼠随机分为组，即对照组和七氟烷组，每组 只。根据文献 ，按体质量换算七氟烷剂量，周龄小鼠应为 ，而新生小鼠的推荐剂量为 ，因此，本实验采用。在气体麻醉室中，七氟烷组小鼠暴露在 七氟烷中（以空气为载体，进气速率 ），如小鼠出现呼吸急促或明显的全身抽搐，立即终止麻醉。对照组小鼠暴露在空气中。温度维持在，处理。染色实验结束后小鼠予安乐死，取海马组织，多聚甲醛固定 。脱水，石第期刘玉明，等：长链非编码 参与七氟烷诱导的海马神经元凋亡蜡包埋切片，厚度。切片经脱蜡、复水，蛋白酶 处理 ，过 氧 化 氢 溶 液 处 理 。反应混合液 孵育。清洗，标记的地高辛 孵育 。显色后苏木精复染。倍光镜下计数海马 区域凋亡的锥体细胞，计算凋亡细胞比例（凋亡细胞数 总细胞数）。尼氏染色七氟烷处理后，小鼠予安乐死，取海马组织多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片。切片经脱蜡、复水，焦油紫染色 。蒸馏水清洗，乙醇分色，脱水后封片。显微镜下观察，倍光镜下计数海马 区域尼氏阳性细胞。表达芯片数据分析在 数据库中搜索 相关的表达谱数据，删除实验重复数的数据，最终确定 （小鼠）作为 后 续 分 析 的 数 据。利 用 软 件 和 包获取 数据和注释数据，包 的方 法 进 行 差 异 分 析，错 误 发 现 率（，）方 法 进 行值 校 正。校 正 记为差异显著。提取和 七氟烷处理结束后，七氟烷组只（死亡只）和对照组 只小鼠安乐死，分离海马组织，法提取总，合成试剂盒，用随机对引物进行反转录反应。染料法进行 （表）反应，作 为 内 参，法 进 行 定 量 分 析，进行计算，检验进行统计分析，为差别有统计学意义。表引物及序列 引物名称正向反向 结果 七氟烷处理引起海马组织病变和细胞凋亡对照组海马锥体神经元排列有序，边界清晰；七氟烷组海马锥体神经元排列紊乱，分层减少，部分细胞呈现边界不清晰的特征（图）。统计结果显示，七氟烷处理后，七氟烷组正常的锥体神经元明显减少。同时，凋亡染色结果显示（图），七氟烷组中 阳性细胞较对照组显著增加，提示七氟烷处理可引起海马组织神经元细胞凋亡。生物信息分析数据集 发现了 个差异表达的 ，其中 个表达上调，个表达下调（图）。验证个差异表达的 按照表达量倍数差异，对差异表达的 进行排序，选择七氟烷处理后表达上调排列前的 进行验 证（、和 ）。结 果 显 示，和 经七氟烷处理后表达上调（图）。为了分析 和 可能的功能，本研究进行了 和差异表达的 的关联分析。和 具有相似的关联基因（个正相关，个负相关，图）。基因集富集分析发现（图），这些关联基因可能参与调节突触形成和碳水化合物的代谢过程。讨论七氟烷是手术过程中广泛使用的气体麻醉药物，但其在手术中诱导副作用的机制仍未知。研究表明，和麻醉药物的效果及副作用有密切关系。因此，本研究采用生物信息学方法分析了 数据库中七氟烷处理小鼠后 相关的表达谱数据，并对结果进行了验证。本研究发现，小鼠经 七氟烷处理后，海马神经元有明显的结构异常，而且凋亡比例显著增高，与文献报道一致。生物信息分析结果显示，数据集只有 个 的表达差别有统计学意义，较少数量的差异表达 可能是因为数据集中只有个重复样本，样本量少使得小鼠之间的个体差异对结果影响更大。此外，福建医科大学学报 年分别用尼氏染色（）和 染色的方法（）检测七氟烷对 锥体神经元组织形态和凋亡的影响（光镜，倍）；和定量比较七氟烷组和对照组尼氏染色阳性的锥体神经元和 阳性的凋亡细胞比例。：对照组；：实验组。图七氟烷对小鼠海马锥体神经元形态和凋亡的影响 七氟烷处理数据集 （）和 （）经 分析，差异基因由火山图显示，蓝色：表达下调；红色：表达上调（图中显示的差异基因包含 和 ）。图芯片数据分析结果 分析采用的 算法使用经验贝叶斯方法评估倍数变化的标准误差，具有更稳健的推断和更高的功效，特别对于样本量少的实验。但这种严格的方法，可能会使一些差异小但具有生物学意义的 被认为无统计学差异。文献表明，在七氟烷吸入麻醉中副作用有一定的影响。比如，可以结合沉默转录因子 的辅助抑制蛋白 和 ，抑 制 脑 源 神 经 营 养 因 子（，）的表达。在麻醉的同时，下调 的表达可一定程度解除七氟烷对 的抑制作用，改善认知。而 可通过 通路改善七氟烷吸入麻醉引起的神经疼痛并改善认知失调。此外，麻醉小鼠吸入七氟烷，表达升高。因此，本课题采用 的方法对 数据集中差异水平排序前的 进行了验证，结 果 发 现 仅 有 个 （和 ）经七氟烷处理后表达上调，而上调的程度并不是很大，均未超过倍。比对分析发现，这个差异表达的 只在小鼠中表达，人类中没有相应的同源基因。此外，大部分 由于第期刘玉明，等：长链非编码 参与七氟烷诱导的海马神经元凋亡对照组和七氟烷组小鼠处理后分离海马组织，提取总 并反转录为 。染料法进行定量 ，为内参，法进行相对定量计算，进行图像处理和统计分析（检验）。：对照组；：实验组。图 验证表达谱数据 生物信息分析得到的差异表达基因与 和 进行关联分析，按照相关系数大小，利用 绘制热图，红色表示正相关，蓝色表示负相关，颜色越深，表示相关性越强（）；与 和 相关的基因，通过 网页工具进行基因集分析（），左侧柱状图表示统计学差异显著程度，黄色表示差别极显著（），浅黄色表示差别极显著（）；右侧表示相关基因所参与的通路。图 和 相关基因的基因富集分析 没有进化压力，在物种间通常保守性较低。这表明在利用 解释七氟烷副作用机制或者作为抑制其副作用的靶点时，还应考虑 基因的突变型。为此，本实验搜索了 库，试图寻找人类或者灵长类七氟烷处理的数据。结果仅存在个人 类 数 据（）和 个 恒 河 猴 数 据（），且这个数据集都仅有个样本，不足以进行后续的统计分析。因此，参与七福建医科大学学报 年氟烷的药物效果及副作用程度仍有疑问，需要进行进一步的数据分析与实验验证。文献 表明，新生小鼠暴露于七氟烷可以诱导 上调表达，这与本课题结果一致。是一个新的七氟烷诱导基因，基因关联分析发现，和 具有相似的关联基因，表明这个 可能通过相似的通路发挥作 用。进 一 步 的 基 因 集 分 析 发 现，和 关联的基因富集于突触，这与本实验观察到的七氟烷引起小鼠海马神经元的损伤有一定关联性。如与 和 正相关的 蛋白（，甲基化 结合蛋白）在压力和抑郁条件下，可以调节突触的可塑性。提示这个 可能参与了突触形成和碳水化合物的代谢过程。总之，七氟烷处理可引起小鼠海马组织结构异常和细胞凋亡，亦可引起 表达的异常，提示 参与了七氟烷的作用过程。另外，本课题发现，虽然七氟烷处理可改变部分 的表达，但这些 的表达仅限于小鼠，在人类基因组中没有相应的同源基因。因此，在利用 来阐述七氟烷作用机制时，应考虑物种的差异。参考文献：，（）：，（）：，：（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：第期刘玉明，等：长链非编码 参与七氟烷诱导的海马神经元凋亡 ，；，：（），（）：；（编辑：何佳凤）（上接第 页）（），（）（）（）（）（）（），（），（），（）（），（）：；（编辑：张慧茹）