指纹图谱及多成分定量结合化...别法评价不同规格西洋参质量_毛英民.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药药效成分及质量评价指纹图谱及多成分定量结合化学模式识别法评价不同规格西洋参质量毛英民1，赵大庆1，黄宝泰2，李佳奇1，陈昊媛2，刘莉2，齐滨2（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院 长春 130117；2.长春中医药大学药学院 长春 130117）摘要：目的根据HPLC指纹图谱和多种人参皂苷类成分的含量测定，并结合化学模式识别法，比较不同产地、不同年限、不同种植方式的西洋参质量，为其进一步开发利用提供依据。方法HPLC法得到20批不同规格的西洋参色谱图，用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012版）进行评价，对其中的11种人参皂苷测定含量，并运用聚类分析和主成分分析对其进行区分比较。结果选取了28个色谱峰作为指纹图谱的共有峰，20批西洋参药材的指纹图谱相似度均大于0.90，通过与对照品比对指认出其中的11种人参皂苷类成分（Rg1、Re、Rg2、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rh2），未检测到人参皂苷Rf。产地对西洋参的质量影响较大，进口西洋参中人参皂苷含量较高，在国内集安的西洋参中人参皂苷含量较高，此外西洋参生长年限越高，人参皂苷含量越高；在国内移栽种植的质量要高于直播种植。20批西洋参药材的聚类分析和主成分分析结果相似，进口西洋参和集安的西洋参较为相似，长白和抚松的西洋参较为相似，文登西洋参单独成一类；造成西洋参质量差异的主要成分是人参皂苷Rb1、Re、Rd、Ro。结论指纹图谱与含量测定相结合，应用聚类分析及主成分分析可全面评价西洋参质量，人参皂苷类成分可以作为西洋参质量控制的指标性成分，该方法能为西洋参的质量控制及评价提供参考。关键词：西洋参（水饱和）正丁醇提取物 HPLC 指纹图谱 含量测定 聚类分析 主成分分析doi:10.11842/wst.20210811012 中图分类号:R284.1 文献标识码:A 西洋参（Panax quinquefolium L.）是五加科人参属多年生草本植物，此品味甘微苦，性凉，归心、肺、肾经，善益气、养阴、清热、为清补佳品1。西洋参别名花旗参、洋参、西洋人参。我国有着西洋参生长和繁衍的优越自然生态条件，目前是西洋参生产的主要地区2。西洋参是多年生宿根性植物，从播种到收获，需要4年时间，目前我国常见的西洋参种植方式有两种，分别为移栽和直播，国外西洋参种植均为直播 4年。西洋参的产地、生长年限和种植方式都会影响其质量。西洋参主要有效成分为人参皂苷类成分，以往的质量控制指标一般测定几种常见的单体皂苷含量，例如Rg1、Re、Rb1，这几种皂苷很难反映西洋参的整体质量。本研究运用指纹图谱及多成分定量结合化学模式识别法可以为西洋参的质量控制提供有力的支撑。近年来，西洋参指纹图谱的研究较少，已有的研究虽然在西洋参质量控制上有所贡献，但是还有许多方面有待提高，有的很多的化学组分没有分开，导致共有峰太少；有的指认出的有效成分太少；有的对西洋参不同产地进行指纹图谱研究，有的对西洋参的不同炮制品种进行指纹图谱研究。目前西洋参不同年限、不同种植方式的HPLC指纹图谱尚未见报道。本实验采用HPLC法，对原产地美国和加拿大4年生西 收稿日期：2021-08-11 修回日期：2022-03-24 国家科学技术部重点研发计划项目（2017YFC1702100）：人参产业关键技术研究及大健康产品开发，负责人：赵大庆。通讯作者：齐滨，教授，硕士生导师，主要研究方向，中药炮制化学成分的研究；刘莉，副教授，硕士生导师，主要研究方向，中药药效物质基础的研究。4207 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2022 第二十四卷 第十一期 Vol.24 No.11 洋参和我国4个产地的不同年限的西洋参以及不同种植方式下的西洋参建立指纹图谱，其分离度及重现性都较好，对相似度进行了比较，并指认出共有峰中的11种人参皂苷成分，求得其含量，为西洋参的选用提供了参考3。1 仪器与材料 1.1仪器Thermo-Ultimate 3000 型高效液相色谱仪，VWD检测器，Chromeleon 7.2工作站，KQ-600E型超声波清洗器，循环水式多用真空泵，玻璃砂芯过滤装置，AK-400A 型粉碎机，HH-6 型数显恒温水浴锅，梅特勒AB135-S型十万分之一电子天平。1.2药品与试剂人参皂苷 Rb1（批号 DSTDR000601）、Rb2（批号DSTDR000765）、Rb3（批号 DSTDR000802）、Rc（批号DST201029-013）、Rd（批号 DSTDR001501）、Re（批号DSTDR001401）、Rf（批号DST201105-017）、Rg1（批号 DSTDR000901）、Rg2（批号DSTDR001001）、Rg3（批号DST200401-011）、Rh2（批号DSTDS003601）、Ro（批号DST191226-031）对照品均购自乐美天医药德思特生物有限公司，正丁醇（分析纯），乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），磷酸（分析纯），屈臣氏饮用水。1.3样品国内西洋参采购于4个不同的产地，分别是吉林产区的集安、长白、抚松地区，以及山东产区的文登地区，每个产地均采购育苗 2 年生西洋参、移栽 3 年和4年生西洋参、直播4年生西洋参；进口西洋参产自美国和加拿大，品牌分别为同仁堂、总统牌、养津堂、威格维尔，均为直播4年生西洋参。移栽3年和4年的西洋参，是把西洋参的种子，播种在参地中，育苗生长2年后，再移栽到另一块参地里，继续生长1、2年。直播4年生西洋参，把西洋参的种子，播种在参地中，连续生长4年4。所购得的西洋参，经长春中医药大学肖井雷副教授鉴定均为五加科植物西洋参（Panax quinquefolium L.）的根，结果见表1。2 方法与结果 2.1色谱条件色 谱 柱：安 捷 伦 ZORBAX SB-Aq C18 色 谱 柱（4.6 mm250 mm，5 m）；流动相：A为乙腈和B为0.05%磷酸水溶液，方法按表2进行梯度洗脱5；检测波长为203 nm；柱温26.5；进样量10 L；流速1 mLmin-1。理论板数按人参皂苷Rb1峰计算应不低于5000。2.2对照品溶液的制备用十万分之一的电子天平，精密称取12种人参皂苷对照品 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Ro，加色谱级甲醇定容，混匀后用 0.22 m滤膜滤过，取续滤液制成上述12种单体皂苷的混合对照品溶液，浓度分别为 0.740、0.300、0.290、0.305、0.760、0.545、0.285、0.335、0.305、0.385、0.400、0.515 mgmL-1。2.3供试品溶液的制备用粉碎机把西洋参整根粉碎，过三号筛（50目）得表2流动相梯度洗脱表时间（min）0-3030-4040-7070-8080-9090-105105-113流动相A（%）1919-292929-3232-4242-6060流动相B（%）8181-717171-6868-5858-4040表120批不同规格的西洋参编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S20产地东北集安东北集安东北集安东北集安东北长白东北长白东北长白东北长白东北抚松东北抚松东北抚松东北抚松山东文登山东文登山东文登山东文登美国（同仁堂）美国（总统牌）加拿大（养津堂）加拿大（威格维尔）规格育苗生长2年3年（育苗生长2年，移栽生长1年）直播生长4年4年（育苗生长2年，移栽生长2年）育苗生长2年3年（育苗生长2年，移栽生长1年）直播生长4年4年（育苗生长2年，移栽生长2年）育苗生长2年3年（育苗生长2年，移栽生长1年）直播生长4年4年（育苗生长2年，移栽生长2年）育苗生长2年3年（育苗生长2年，移栽生长1年）直播生长4年4年（育苗生长2年，移栽生长2年）直播生长4年直播生长4年直播生长4年直播生长4年4208 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药药效成分及质量评价本品粉末，精密称取其1 g，置于锥形瓶中，加入提前配置好的水饱和正丁醇50 mL，称定其重量，置于超声波清洗器（功率 600 W）中连接好回流装置，采用超声70加热进行提取，1.5 h后停止，取出，放凉，再次称重，补齐超声加热回流中减少的水饱和正丁醇，摇晃均匀，用滤纸过滤6。用量筒量取续滤液25 mL，移至蒸发皿中，在通风厨中70水浴锅上蒸干，加入适量的色谱甲醇使残渣溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇晃均匀，用0.22 m滤膜滤过，取续滤液置于液相小瓶中。2.4方法学考察2.4.1线性关系用十万分之一的电子天平，精密称取12种人参皂苷对照品称取对照品 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Ro，加色谱级甲醇使其溶解，配制成浓度分别为4.710、1.006、1.450、1.025、1.350、2.725、1.025、1.075、0.425、0.386、0.365、1.175 mgmL-1的混合对照品储备溶液，再用甲醇将其稀释 2、5、10、20、25倍，制成5种不同浓度的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样，将得到的结果以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得到每种成分的回归方程和线性范围7，结果见表3，表明在定量范围内各成分的线性良好。2.4.2精密度实验取配制好的供试品溶液1份，按2.1项下色谱条件连续进样6次，将峰型较好、保留时间和峰面积大小适中的共有色谱峰Ro为参照峰,计算28个共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，计算得到各共有峰相对保留时间RSD1%，相对峰面积的RSD3%，表明仪器精密度良好。2.4.3稳定性实验取配制好的供试品溶液1份，在制备0、6、12、24、36、48 h后，按2.1项下色谱条件进样，将峰型较好、保留时间和峰面积大小适中的共有色谱峰Ro为参照峰，计算28个共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，计算得到各共有峰相对保留时间RSD1%，相对峰面积的RSD3%，表明供试品溶液在48 h内稳定性较好8。2.4.4重复性实验取配制好的供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件进样,将峰型较好、保留时间和峰面积大小适中的共有色谱峰Ro为参照峰，计算28个共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，计算得到各共有峰相对保留时间RSD1%，相对峰面积的RSD1、累计贡献率80%作为提取标准，可提取到 2个主成分，第一主成分贡献率最高为70.676%，第二主成份贡献率为 11.550%，2个主成分累积贡献率为 82.226%，由此可知前2个主成分能反映西洋参中11种人参皂苷的含量信息。根据得到的主成分，建立含有2个主成分的PCA模型，其中R2X（cum）表示在进行多元统计分析时，其在X轴方向上保留原始数据信息的百分比平方，其大小为0.995；Q2（cum）为整体模型预测能力参数，大小为0.88。整体来说建立的模型区分度和预测程度都较好14。建立含2个主成分的坐标系，得到PCA得分图，见图4。从PCA得分图中我们可以得到20批西洋参的分类信息，可以看出东北集安产区的西洋参（S1-S4）和山东文登产区的西洋参（S13-S16）以及国外西洋参（S17-S20）在PCA得分图上，比较明显的被分到独立区域，而东北长白产区的西洋参（S5-S8）和东北抚松产区的西洋参（S9-S12）在PCA得分图上分布较集中，两