植物乳杆菌N3117发酵乳...的糖尿病大鼠肠道菌群的影响_张博玮.pdf

2023年第51卷第4期（总第389期）植物乳杆菌 N3117 发酵乳对二甲双胍治疗的糖尿病大鼠肠道菌群的影响张博玮1，李晴1，赵宝华1，张栋2，边艳青1（1.河北师范大学生命科学学院，石家庄 050024；2.石家庄君乐宝乳业有限公司，石家庄 050221）摘要：探究了以植物乳杆菌 N3117 为活菌成分的益生菌发酵乳对二甲双胍治疗的糖尿病大鼠肠道菌群的影响。利用高脂饮食联合链脲佐菌素诱导 2 型糖尿病大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为糖尿病组（DM）、二甲双胍治疗组（Met）以及发酵乳和二甲双胍联合干预组（MLf）；正常饮食的大鼠为对照组（Con）。每周记录大鼠体重及血糖水平。收集大鼠粪便，采用 16S rRNA 高通量测序对大鼠肠道菌群进行分析。与 DM 组大鼠相比，Met 组空腹和餐后血糖显著降低（P0.05），但仍显著高于 Con 组（P0.05）；与 Con 组相比，DM 和 Met 组肠道菌群 shannon 指数和 simpson 指数均显著下降（P0.05），而且厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著降低（P0.05）；但与DM 组相比，Met 组寡源杆菌、棒状杆菌等肠道有害菌的丰度增加。与 DM 组相比，MLf 组血糖水平显著降低（P0.05），simpson 指数显著升高（P0.05），厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著升高（P0.05），乳酸杆菌、毛螺菌等有益菌的丰度增加，肠道菌群向 Con 组的组成靠近。结果表明联合干预能够在发挥降糖作用的同时，在一定程度上调节大鼠肠道菌群结构，缓解因糖尿病及二甲双胍治疗而导致的肠道菌群失调。关键词：2 型糖尿病；植物乳杆菌；发酵乳；肠道菌群中图分类号：Q93-337文献标识码：A文章编号：1001-2230(2023)04-0004-07doi:10.19827/j.issn1001-2230.2023.04.001Effect of Lactobacillus Plantarum N3117 fermented milk on intestinal flora ofdiabetes rats treated with metforminZHANG Bowei1,LI Qing1,ZHAO Baohua1,ZHANG Dong2,BIAN Yanqing1(1.College of Life Sciences,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050024,China;2.Shijiazhuang Junlebao Dairy Co.Ltd.,Shijiazhuang 050221,China)Abstract：To investigate the effects of probiotic fermented milk with Lactobacillus plantarum N3117 as living bacteria on intestinal microflora of diabetic rats treated with metformin were investigated.High-fat diet combined with streptozotocin was used to induce type 2 diabetes in rats.The ratswere randomly divided into diabetic rats group(DM),metformin treatment group(Met),and combined fermented milk and metformin intervention group(MLf);rats with normal diet were the control group(Con).The body weight and blood glucose levels of rats were recorded weekly.Feces of rats were collected and the intestinal flora of rats was analyzed by 16S rRNA high-throughput sequencing.Compared with DM group,fasting and postprandial blood glucose in Met group was significantly decreased(P0.05),but it was still significantly higher than that in Con group(P0.05).The analysis of intestinal flora showed that compared with the Con group,the shannon index and simpson index of DM and Met groupsmarkedly decreased(P0.05).And the ratio of Firmicutes to Bacteroidetes decreased significantly between the DM and Met groups too(P0.05).But compared with DM group,the abundance of intestinal harmful bacteria such as oligobacteria and Corynebacterium increased.Compared with DMgroup,the blood glucose level was significantly decreased(P0.05)and simpson index were significantly increased in MLf group(P0.05),and theratio of Firmicutes to Bacteroidetes,and the abundance of beneficial bacteria such as Lactobacillus and Lachnospira was increased(P0.05),the intestinal flora is close to the composition of Con group.The results showed that the combined intervention could not only play a hypoglycemic role,butalso regulate the intestinal microflora structure of rats to a certain extent,and alleviate the intestinal microflora imbalance caused by diabetes andmetformin treatment.Key words：type 2 diabetes mellitus;Lactobacillus Plantarum;fermented milk;intestinal flora0 引言近年来由于高盐、高脂、高糖饮食导致的糖尿病发病率逐年上升，对人体健康造成威胁1。糖尿病分为1 型糖尿病（T1DM）和 2 型糖尿病（T2DM），其中 2收稿日期：2022-05-30基金项目：河北省重点研发计划项目（20312804D）。作者简介：张博玮（1998-），女，硕士，研究方向为分子细菌学。通讯作者：边艳青4Vol.51，No.4 2023(total 389)型糖尿病患者约占糖尿病总病患 95%2。盐酸二甲双胍具有良好的降糖效果，目前临床利用盐酸二甲双胍治疗 T2DM 较为普遍。研究发现，T2DM 会造成患者肠道菌群失调，而长期服用二甲双胍会加重 T2DM 患者的腹泻、便秘，使肠道菌群失衡更加严重3。肠道菌群是人体最大的微生态系统，对人体具有重要的生理功能，参与人体的物质和能量代谢，可通过“微生物肠脑轴”影响机体大脑的功能和中枢神经系统的发育4。因此，在降低血糖的同时，改善患者肠道菌群是治疗T2DM 中需要重点关注的靶点。发酵乳制品是益生菌的优良载体，具有调节肠道菌群的作用。已有研究表明植物乳杆菌 N3117 菌株对低 pH 值和高胆汁酸盐具有较强的抗性，发酵特性优良，适用于高活菌数发酵乳的制备5。刘尧尧等用植物乳杆菌 N3117 菌粉干预肥胖大鼠，明显改善了其炎症反应和肠黏膜屏障功能6。本研究前期已证明活菌数为 107CFU/mL 的 N3117 发酵乳对 T2DM 大鼠的生理指标表现出更好的干预效果。利用植物乳杆菌N3117 菌株制备的发酵乳能否改善长期服用二甲双胍引起的肠道菌群紊乱还未见相关报道，因此本研究采用 16S rRNA 高通量基因测序技术，研究了其对二甲双胍治疗的 T2DM 大鼠肠道菌群的影响，从而为开发适用于服用二甲双胍治疗的 T2DM 患者的发酵乳制品提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株植物乳杆菌 N3117 菌株，分离自内蒙古传统发酵乳制品，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏编号为 CGMCC 10133，由石家庄君乐宝乳业有限公司提供。1.1.2 动物及饲料SPF 级健康雄性 SD 大鼠 24 只，体重 180220 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证号：No.210726210100404183，许可证号：SCXK（辽）2020-0001。基础饲料和高脂饲料购自北京博泰宏达生物技术有限公司，含碳水化合物 42.1%（质量分数，下同）、脂肪 25.4%、蛋白质 24.2%，于20 冰箱保存。1.1.3 试剂与仪器柠檬酸、柠檬酸钠、MRS 琼脂培养基，索莱宝生物科技有限公司；链脲佐菌素（S6089）、盐酸二甲双胍（M813341），麦克林企业有限公司；三诺易准 GA-3血糖试纸（synz01）、三诺易准 GA-3 血糖仪（synz02），北京康为世纪科技有限公司。高压蒸汽灭菌锅，日本 Panasonic 公司；80 超低温冰箱，青岛海尔集团；低温离心机，德国 Eppendorf 公司；电子分析天平，日本 Shimadzu 公司；烘箱，北京永光明医疗仪器有限公司；37 恒温培养箱，上海新苗医疗器械。1.2 方法1.2.1 发酵乳制备流程标准化鲜牛奶（预热5055）加入质量分数7%的白砂糖搅拌均匀后水合30 min 均质（5560，20 MPa）杀菌（9095，5 min）冷却至42 接种发酵至pH为4.44.5破乳冷却（20 左右）灌装封口冷藏成品1.2.2 保质期内活菌数测定吸取 1 mL 4 保存的发酵乳制品加入 9 mL 的生理盐水中进行 10 倍梯度稀释，取 100 L 稀释液接种于 MRS 培养基中，37 培养 48 h，选取菌落数在30300 之间的平板计数，最终浓度以每毫升菌液的菌落形成单位（Colony Forming Unit,CFU）平均值表示。分别在 0、7、14、21、28 d 测定发酵乳的活菌数。1.2.3 动物分组及模型建立适应性喂养 1 周后，随机分组为正常对照组（Con，n=6）和糖尿病模型组（n=18），分别喂养普通饲料和高脂饲料。第 5 周糖尿病造模组大鼠用 0.1 mmol/L pH 为4.5 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制 1%链脲佐菌素（STZ）溶液造模，按照大鼠体重 30 mg/kg 的给药量腹腔注射 STZ。一周后于大鼠的尾静脉取血测量血糖值，若测得空腹血糖值7.8 mmol/L，餐后 2 h 血糖值11.1 mmol/L 则判定为造模成功，未达标大鼠于第 6 周用同剂量 STZ 再次进行腹腔注射，剔除造模失败的大鼠。7、8 周作为模型巩固期，糖尿病造模组继续喂食高脂饲料。选取