山羊ZFP36L1基因克隆及表达特性分析_马箫彤.pdf

马箫彤 等/山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1696-1709 DOI:10.13345/j.cjb.220719 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：国家自然科学基金(82002817)；四川省科技厅项目(2022NSFSC0067)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(82002817)and the Foundation from Science and Technology Department of Sichuan Province(2022NSFSC0067).#These authors contributed equally to this work.*Corresponding author.E-mail: Received:2022-09-07;Accepted:2022-10-17;Published online:2022-10-19 1696 生物工程学报 山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 马箫彤1#，王瑞龙1,2#，王菲1，陈定双1,3，李艳艳1,3，林亚秋1,3，王友利1,3，刘伟1,3*1 西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041 2 赤峰应用技术职业学院，内蒙古 赤峰 024031 3 西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室，四川 成都 610041 马箫彤,王瑞龙,王菲,陈定双,李艳艳,林亚秋,王友利,刘伟.山羊ZFP36L1基因克隆及表达特性分析J.生物工程学报,2023,39(4):1696-1709.MA Xiaotong,WANG Ruilong,WANG Fei,CHEN Dingshuang,LI Yanyan,LIN Yaqiu,WANG Youli,LIU Wei.Cloning and expression profile of ZFP36L1 gene in goatJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1696-1709.摘 要：本研究旨在克隆获取锌指蛋白家族 36(zinc finger protein 36-like 1,ZFP36L1)基因，并明确其表达特性，阐明其在山羊不同组织中的表达模式。采集简州大耳羊的心、肝、脾、肺、肾等15 种组织样品，应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增获得山羊 ZFP36L1 基因，通过在线工具对基因及蛋白质序列进行生物学分析；再应用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测 ZFP36L1 基因在山羊各个组织及不同分化阶段的肌内前体脂肪细胞中的表达水平，并分析其组织表达谱以及细胞时序表达谱。结果表明，克隆获得山羊 ZFR36L1 基因序列长度为 1 224 bp，编码序列(coding sequence,CDS)区为 1 017 bp，编码 338 个氨基酸，是主要定位于细胞核、细胞质的非分泌不稳定蛋白；组织表达谱显示，ZFP36L1 基因在各组织中均有表达，在内脏组织、小肠表达量最高(P0.01)。在肌肉组织以背最长肌表达量最高(P0.01)。在脂肪组织中，皮下脂肪组织的表达量显著高于其他组织(P0.01)。诱导分化结果显示，该基因在肌内前体脂肪细胞成脂分化过程中表达呈上调趋势(P0.01)。以上研究为阐明山羊 ZFP36L1 基因的生物学功能提供数据支持。关键词：山羊；ZFP36L1；基因克隆；肌内前体脂肪细胞；诱导分化 动物及兽医生物技术 马箫彤 等/山羊 ZFP36L1 基因克隆及表达特性分析 ：010-64807509： 1697 Cloning and expression profile of ZFP36L1 gene in goat MA Xiaotong1#,WANG Ruilong1,2#,WANG Fei1,CHEN Dingshuang1,3,LI Yanyan1,3,LIN Yaqiu1,3,WANG Youli1,3,LIU Wei1,3*1 College of Animal Science and Veterinary Medicine,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,Sichuan,China 2 Chifeng Vocational Institute of Applied Technology,Chifeng 024031,Inner Mongolia,China 3 Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization,Ministry of Education,Sichuan Province,Southwest Minzu University,Chengdu 610041,Sichuan,China Abstract:The purpose of this study was to clone and characterize the ZFP36L1(zinc finger protein 36-like 1)gene,clarify its expression characteristics,and elucidate its expression patterns in different tissues of goats.Samples of 15 tissues from Jianzhou big-eared goats,including heart,liver,spleen,lung and kidney were collected.Goat ZFP36L1 gene was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),then the gene and protein sequence were analyzed by online tools.Quantitative real-time polymerase chain reaction(qPCR)was used to detect the expression level of ZFP36L1 in intramuscular preadipocytes in different tissues and adipocytes of goat at different differentiation stages.The results showed that the length of ZFR36L1 gene was 1 224 bp,and the coding sequence(CDS)region was 1 017 bp,encoding 338 amino acids,which was a non-secretory unstable protein mainly located in nucleus and cytoplasm.Tissue expression profile showed that ZFP36L1 gene was expressed in all selected tissues.In visceral tissues,the small intestine showed the highest expression level(P0.01).In muscle tissue,the highest expression level was presented in longissimus dorsi muscle(P0.01),whereas the expression level in subcutaneous adipose tissue was significantly higher than that in other tissues(P0.01).The results of induced differentiation showed that the expression of this gene was up-regulated during adipogenic differentiation of intramuscular precursor adipocytes(P0.01).These data may help to clarify the biological function of the ZFP36L1 gene in goat.Keywords:goat;ZFP36L1;gene cloning;intramuscular preadipocyte;induced differentiation 随着生活水平的不断提高，人们对肉品质的要求也不断提高；羊肉因其味美、低胆固醇以及营养丰富而越来越受喜爱1。肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量指沉积在肌肉内的脂肪含量，可影响肉质的风味、嫩度、色泽和多汁性等感官特征2。因此，从分子水平寻找影响肉羊脂肪沉积的关键调控分子具有重要意义，可为肉羊分子育种提供基础生物学证据。RNA 结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)是一类通过与 RNA 特异性结合、调节转录后基因表达的蛋白质3。由于全过程参与 RNA 的成熟、修饰、转运、定位及翻译，RNA 结合蛋白决定了 RNA 的命运及功能，对细胞的生理代谢至关重要4。C3H1 型锌指蛋白 36(zinc finger protein 36-like 1,ZFP36L1)是一种高度保守、具有CCCH型RNA结合结构域的RNA结合蛋白5。作为人类最大的转录因子锌指蛋白家族(zinc finger protein,ZFP)的一员，ZFP36L1 在转录水平调节脂肪细胞的分化。如 Liu 等6在使用左旋咪唑治疗再生障碍性贫血(aplastic anemia,ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1698 AA)的研究中发现在左旋咪唑作用下，ZFP36L1 的表达增加，进而介导 PPARGC1B mRNA 的降解，最终抑制 AA 患者骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。Tseng 等7则在小鼠中证实 ZFP36L1 通过抑制过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR2)的表达，促进了成骨细胞的分化，抑制多能干细胞向脂肪分化。这些证据均暗示，ZFP36L1 在真核生物脂肪代谢中扮演了重要角色。简州大耳羊，是由美国于 1940 年赠予我国的努比亚羱羊(Capra nubiana)与四川省龙泉山脉一带的麻羊经过 63 年的杂交选育形成的山羊新品种8-10。作为我国人工培育的第二个肉用山羊品种，简州大耳羊体格健硕、生长速度快、产羔率稳定、肉质鲜美，已自我国西南地区逐渐推广至两湖、两广及河南等省区，并在 2011 年被国家质检总局登记为中国国家地理标志产品11-12。作为我国优良的肉用山羊品种，本研究以人类脂肪细胞分化中已证实的关键因子 ZFP36L1 为生物标志，探究其在简州大耳羊不同组织及时序下的表达规律，为阐明简州大耳羊脂肪沉积的调控机制，改善其肉质性状，推进其分子育种提供科学依据和技