三种桑黄子实体脂溶性成分的GC-MS分析及抗氧化活性_罗阳兰.pdf

技术与方法生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):149-157收稿日期：2022-10-17基金项目：广西农业科学院科技发展基金项目（桂农科 2021JM85），广西农业科学院科技发展基金项目（桂农科 2022JM07）作者简介：罗阳兰，女，硕士，助理研究员，研究方向：微生物代谢；E-mail:通讯作者：阎勇，男，硕士，研究员，研究方向：微生物代谢；E-mail:三种桑黄子实体脂溶性成分的 GC-MS 分析及抗氧化 活性罗阳兰1 曹乃馨2 杨玉梅3 黄丽玲1 阎勇1 黄世旅1（1.广西农业科学院微生物研究所，南宁 530007；2.陕西理工大学，汉中 723000；3.略阳县农产品质量安全监测检验中心，汉中 724300）摘 要：比较分析不同桑黄子实体脂溶性成分差异，并初步探究其抗氧化活性。采用索氏提取法获得脂溶性成分并进行 GC-MS 分析，计算各化学成分的相对百分含量，测定其还原能力、对 DPPH 自由基、羟自由基的清除能力分析抗氧化活性。GC-MS 结果表明共鉴定到 176 种化合物，JM1、JM2 和 JM3 的脂溶性成分分别有 68、75 和 71 种化合物，对化合物进行归类分析发现主要含有烷类、酯类、芳香族类等物质，共有成分共 8 种，相对含量分别占 JM1、JM2 和 JM3 提取物的 12.88%、9.85%、9.54%，分别为 2,4-二甲基庚烷、乙苯、对二甲苯、苯乙烯、6-十二酮、棕榈酸甲酯、木蜡酸甲酯和四十四烷。3 种子实体中 JM1 脂溶性物质具有更好的抗氧化活性。桑黄子实体脂溶性成分含有多种活性物质，具有一定的生物活性，可为深入研究其药理功效和资源开发提供参考。关键词：桑黄；脂溶性成分；气相色谱质谱联用仪；抗氧化活性DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1275GC-MS Analysis and Antioxidant Activities of Liposoluble Components from Three Sanghuangporus Fruit BodiesLUO Yang-lan1 CAO Nai-xin2 YANG Yu-mei3 HUANG Li-ling1 YAN Yong1 HUANG Shi-Lv1（1.Microbiology Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007;2.Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723000;3.Lueyang County Monitoring and Testing Center of Agricultural Products Quality Safety,Hanzhong 724300）Abstract:This work aims to study components and antioxidant activities of liposoluble components from different Sanghuangporus sp.fruiting bodies.Soxhlet extraction method was applied to extract the liposoluble components from different Sanghuangporus sp.fruiting bodies and their chemical compositions were identified by GC-MS.Its reducing ability was determined,and the antioxidant activity was evaluated by the reducing capacity,1,1-diphenyl 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）free radical scavenging ability and hydroxyl free radical scavenging ability.The GC-MS results suggested that there were 176 identified liposoluble components in total.Liposoluble components of JM1,JM2 and JM3 were 68,75,71 compounds,respectively.After classification and analysis,the compounds mainly contained alkane,ester,aromatic group and other substances.There are 8 common components,and their relative contents account for 12.88%,9.85%and 9.54%of JM1,JM2 and JM3 extracts,respectively,which were 2,4-dimethylheptane,ethylbenzene,1,4-xylene,styrene,6-dodecanone,methyl hexadecanoate,methyl tetracosanoate and tetratetracontane.JM1 liposoluble components had the best antioxidant activities.The liposoluble components of three Sanghuangporus sp.fruiting bodies contained a variety of active substances and had various biological activities,which can provide a reference for the further study of their pharmacological efficacy and resource development.Keywords:Sanghuangporus sp.;liposoluble components;GC-MS;antioxidant activities生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6150桑黄（Sanghuangporus spp.）属担子菌门 Basid-iomycota、蘑菇纲 Agaricomycetes、锈革菌目 Hymeno-chaetales、锈革菌科 Hymenochaetaceae、桑黄孔菌属Sanghuangporus1，是一类多寄生于桑树、杨树等阔叶树树干的多年生珍贵大型药用真菌的总称2。现代药理学研究表明，桑黄子实体、菌丝体、发酵液中含有多糖、黄酮、三萜等多种活性成分3，在消炎止痛4、抗肿瘤5、降血糖6、机体免疫调节7等方面具有良好的药理作用，表现出广阔的市场开发前景。目前，针对桑黄的研究主要集中于野生资源保护8、优良品种选育9、人工栽培技术、活性成分的分离纯化及结构解析10和相关产品开发11等方面，关于其脂溶性成分的研究报道较少，王超儀等12对 6 种桑黄的石油醚提取物进行了抗肿瘤体内试验，测定了其对 H22 荷瘤小鼠抑瘤率、免疫器官指数、免疫因子含量和生存率的影响，结果表明粗毛纤孔菌Inonotus hispidus（Bull.:Fr.）P.Karst.、鲍姆桑黄 Sanghuangporus baumii（Pilt）L.W.Zhou&Y.C.Dai、火木层孔菌 Phellinus igniarius（L.:Fr.）Qul.、杨树桑黄 Sanghuangporus vaninii（Ljub.）L.W.Zhou&Y.C.Dai以及黑壳木层孔菌Phellinus rhabarbarinus（Berk.）G.Cunn.石油醚提取物均可增加各免疫器官指数，从而提高 H22 荷瘤小鼠的机体免疫力，调动机体自身免疫系统对抗和杀死肿瘤细胞，并延长小鼠生存时间。由此可见，桑黄脂溶性成分具有一定的生理活性，具有进一步研究开发的价值。目 前 主 要 用 于 桑 黄 产 业 的 种 类 有 桑 树 桑黄 Sanghuangporous sanghuang、瓦 尼 桑 黄（又称 杨 树 桑 黄）Sanghuangporous vaninii、鲍 姆 桑黄 Sanghuangporous baumii 和 粗 毛 纤 孔 菌 Inonotus hispidus 等13，为明确桑黄类真菌脂溶性成分的组成及抗氧化活性，本研究以 3 种桑黄子实体为研究对象，经组织分离纯化、鉴定确定菌株分类地位，利用索氏提取法提取 3 种桑黄子实体的脂溶性成分，通过 GC-MS 进行组分分析，同时比较其抗氧化活性，旨在为深入研究其药理功效和资源开发利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试材料 3 种供试材料分别为野生桑树林桑黄（JM1）、人工桑树林桑黄（JM2）、桑枝袋料栽培桑黄（JM3），均采自陕西省汉中市略阳县（北纬N3320，东经 E10610）。1.1.2 试剂 总抗氧化能力检测试剂盒：碧云天生物技术；DNA 提取试剂盒：BioTeke；乳酸酚棉蓝染色液：Hopebio。1.1.3 仪器 EYELA N100 O 型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；SW-CJ-1D 型单人超净工作台（上海苏净实业有限公司）；YXQ-LS-50S 型高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；Biotek Epoch2 微孔板分光光度计（美国 BioTek）。1.2 方法1.2.1 菌株菌落及细胞形态 使用酒精棉球分别擦拭桑黄子实体表面，无菌水冲洗后，沿着子实体环棱纹路切开，用手术刀切取子实体内部的组织移到菌株分离平板上，28恒温暗培养，待组织块萌发后，从菌落边缘挑取新鲜菌丝进行进一步纯化培养，直至获得菌丝体纯培养物14。观察并记录子实体、菌落、菌丝体的质地、颜色、形态、色泽等，采用棉蓝染色法在光学显微镜下观察菌丝体的形态和大小。1.2.2 菌株 ITS 分子鉴定 根据试剂盒使用说明进行操作，初步测定菌株 DNA 浓度后，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，-20保存备用。采用真菌通用引物15ITS-1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS-4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）对 ITS 序列进行扩增。PCR 反应体系 50 L：2Taq Master Mix 25 L，10 mol/L 引物各 2 L，DNA 模板 1 L（浓度 10 ng/L），双蒸水补齐至 50 L。反应条件：94预变性 2 min；94变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 60 s，33 个循环；72延伸 2 min，4终止保存。将试验阳性 PCR 产物送上海生工生物工程有限公司测序，并利用 BLAST 进行序列比对后构建系统发育树16。2023,39(6)151罗阳兰等：三种桑黄子实体脂溶性成分的 GC-MS 分析及抗氧化活性1.2.3 样品提取物的制备 将 3 种桑黄子实体剪成小碎块，60干燥恒重后粉碎，密封保存于阴暗处备用。称取 10 g（M）桑黄子实体粉末，以石油醚（60-90）为溶剂索氏提取 3 h，提取 2 次后合并提取液，减压浓缩得到提取物，40恒重后称定质量记作（m），4储存以供短期内使用，按下式计算 3种提取物的得率：提取物得率(%)=Mm100%1.2.4 提取物的 GC-MS 测定1.2.4.1 样品溶液配制 用正己烷配制 3 种提取物10