瑞马唑仑通过调节肺泡巨噬细...减轻脂多糖诱导的急性肺损伤_王静.pdf

实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9doi：10.3969/j.issn.10065725.2023.09.005基金项目：山东省自然科学基金青年项目（编号：ZR2021QH105）；中华国际医学交流基金（编号：Z2018352101）通信作者：王涛Email：瑞马唑仑通过调节肺泡巨噬细胞极化减轻脂多糖诱导的急性肺损伤王静1高煜茹1蔡钱伟3朱委委1黄潇1孙大康2王晓芝1王涛1滨州医学院附属医院1重症医学科，2临床医学实验室（山东滨州 256603）；3山东大学齐鲁医院德州医院胸外科（山东德州 253000）【摘要】目的探讨瑞马唑仑对急性肺损伤（ALI）的作用及潜在分子机制。方法将C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组（Control组）、模型组（LPS组）、瑞马唑仑干预组（RM+LPS组）和瑞马唑仑对照组（RM组），12 h后处死小鼠取材，收集肺泡灌洗液（BALF）、血清和双侧肺组织。通过苏木素伊红（HE）染色、肺组织的湿干质量比（W/D）、BCA法检测BALF中总蛋白含量评价肺损伤情况；采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测BALF和血清中肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL6、IL1、IL10）的含量；通过流式细胞术检测F4/80+标记的巨噬细胞中M1巨噬细胞阳性标志物iNOS+和M2巨噬细胞标志物CD206+的细胞比例；通过实时荧光定量 PCR 和蛋白质免疫印迹分析检测肺组织中 TNF、iNOS、CD206、Arg1 的mRNA和蛋白水平的表达量。结果LPS滴注12 h后小鼠出现明显肺损伤；BALF和血清中TNF、IL6、IL1含量升高；流式细胞术检测iNOS+细胞数量显著增加；肺组织中TNF、iNOS mRNA含量及蛋白水平均显著增加。给予瑞马唑仑干预后，与LPS组相比，RM+LPS组小鼠肺损伤明显改善；BALF和血清中TNF、IL6、IL1含量显著降低，IL10含量显著增加；流式细胞术检测iNOS+细胞数量显著降低，CD206+细胞显著增加；肺组织中TNF、iNOS mRNA含量及蛋白水平均显著降低，CD206、Arg1 mRNA含量及蛋白水平均显著增加。结论瑞马唑仑可通过抑制肺泡巨噬细胞向M1型极化，促进其向M2型极化，减轻炎症反应，缓解脂多糖诱导的ALI。【关键词】脓毒症；急性肺损伤；巨噬细胞极化；瑞马唑仑【中图分类号】R563.9Remimazolam alleviates LPSinduced acute lung injury by regulating macrophage polarizationWANGJing*，GAO Yuru，CAI Qianwei，ZHUA Weiwei，HUANG Xiao，SUN Dakang，WANG Xiaozhi，WANG Tao.*Department of Critical Care Medicine，Binzhou Medical University Hospital，Binzhou 256603，ChinaCorresponding author：Wang TaoEmail：.【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and molecular mechanism of remimazolam on LPSinducedacute lung injury.MethodsC57BL/6 mice were divided into normal control group，acute lung injury group，remimazolam pretreatment group and remimazolam control group，After 12 hours，the mice were sacrificed forBALF，serum and lung tissue collection.Lung injury was evaluated by HE，W/D ratio and total protein concentration in BALF.ELISA was used to detected the contents of TNF，IL6，IL1，IL10.The M1 macrophage markeriNOS+and the M2 macrophage marker CD206+in F4/80+macrophages were detected by flow cytometry and themRNA and protein expressions of TNF，iNOS，CD206 and Arg1 were detected by realtime quantitative PCRand Western blotting.ResultsTwelve hours after intratracheal injection of LPSA，the lung injury score，W/D ratio and total protein concentration in BALF were significantly higher，the TNF，IL6，IL1 in BALF and serumwas significantly increased，iNOS+macrophage was significantly increased，the mRNA and protein expressions ofTNF and iNOS were significantly increased，as compared with the control group.After activated by remimazolam，the lung injury score，W/D ratio and total protein concentration in BALF were significantly decreased，theTNF，IL6，IL1 in BALF and serum was significantly decreased，IL10 was significantly increased，iNOS+macrophage was significantly decreased，CD206+macrophage was significantly increased，the mRNA and proteinexpressions of TNF and iNOS were significantly decreased，the mRNA and protein expressions of CD206 and Arg1 were significantly increased，as compared with the LPS group.ConclusionRemimazolam alleviates LPSinduced acute lung injury by inhibiting macrophage polarization to M1 phenotype and promoting the macrophage po基 础 研 究1092实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9larization to M2 phenotype.【Key words】sepsis；acute lung injury；macrophage polarization；remimazolam急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是脓毒症患者最常见的并发症1。巨噬细胞是参与ALI/ARDS渗出、增生和纤维化阶段的重要效应细胞，可被组织微环境中的介质激活，将它们极化为具有促炎/细胞毒性作用的M1巨噬细胞和具有抗炎/伤口修复能力的M2巨噬细胞2。目前临床上尚未有针对 ALI 的特异性治疗方法，因此需要寻找新靶点来防治ALI3。在临床上，常应用镇静药物减轻脓毒症患者应激，降低氧耗，因此选择兼具抗炎作用的镇静药物，势必能够缩短患者机械通气的时间，改善患者的预后。瑞马唑仑比目前的咪达唑仑等同类药物具有起效时间快、意识恢复时间短的优点4。以往研究5证明，同为苯二氮类镇静药物的咪达唑仑可作用于肝巨噬细胞减轻炎症反应。研究67发现瑞马唑仑在脓毒症肝损伤、脓毒症免疫等方面具有保护作用，但其对于ALI及肺巨噬细胞的作用及具体机制尚不明确，因此，本研究采用气管滴注脂多糖（LPS）法构建 ALI 小鼠模型，观察瑞马唑仑对 ALI 的保护作用，并探讨其对巨噬细胞 M1/M2 表型极化及炎症反应的影响，为防治ALI提供理论依据。1材料与方法1.1实验动物实验所用C57BL/6雄性小鼠（20 2）g；周龄为68周，购于山东济南朋悦实验动物繁育有限公司（SCxK（鲁）2014007），饲养于滨州医学院附属医院动物房，温度：（22 20）；湿度：（50 10）；昼夜循环照明各 12 h，标准饲料喂养，自由进食、水。本研究经滨州医学院附属医院实验动物伦理委员会审批（审批号：20220128131）。1.2动物分组与处理将C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组（Control组）、模型组（LPS组）、瑞马唑仑干预组（RM+LPS 组）和瑞马唑仑对照组（RM 组）。通过气管滴注 5 mg/kg LPS 建立 ALI 模型8；对照组气管滴注等量生理盐水；RM+LPS 组造模前 30 min 腹腔注射 16 mg/kg 瑞马唑仑，造模后 30 min 皮下注射 8 mg/kg 瑞马唑仑；RM 组气管滴注等量生理盐水同时给予瑞马唑仑。12 h后取材，充分暴露小鼠的气管，用注射器向气管中缓慢注射0.5 mL预冷的PBS，30 s后将液体吸出，重复3次后，将收集的肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavagefluid，BALF）暂时放置于 4 冰箱中保存，采用眼球取血法取血 1 mL，摘取双侧肺组织，检测相关指标。1.3肺湿/干质量（wet/dry，W/D）比值取小鼠新鲜的右下肺称湿质量，放入60 烤箱中烘烤48 h，取出称干质量，两者比值即为肺W/D比值。1.4肺组织苏木素伊红（hematoxylineosin，HE）染色及肺损伤病理评分取肺组织切片，常规脱蜡水化后进行HE染色，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察拍照。从肺泡腔及肺泡间隔炎症细胞浸润、有无透明膜形成、出血程度、肺泡间隔增厚等方面进行肺损伤评分9。1.5BCA法检测BALF总蛋白浓度将收集好的BALF 离心获得上清，用BCA试剂盒检测BALF 蛋白浓度。1.6ELISA 法检测 TNF、IL1、IL6 和 IL10水平将收集好的BALF上清液和血清，按照说明使用ELISA试剂盒分别进行测定。1.7流式细胞数术检测 iNOS+、CD206+细胞百分比将收集好的BALF离心获得细胞沉淀，重悬后用 FITC 标记的抗小鼠 F4/80 单克隆抗体孵育 30min，进行固定与破膜，与APC标记的抗小鼠iNOS抗体、PE 标记的抗小鼠 CD206 抗体混匀孵育 30min，PBS 清洗未结合抗体，重悬后用流式细胞仪检测BALF中F4/80+iNOS+和F4/80+CD206+细胞数目百分比。1.8RTPCR检测TNF、iNOS、CD206和Arg1表达用Trizol法提取肺组织RNA后，测定纯度和浓度，按照说明书要求进行逆转录反应。实时荧光定量 PCR 的程序为：预变性 95 30 s；变性95 5 s，退火/延伸 60 10 s，45 个循