三株异菌脲高效降解菌株的筛选、鉴定及其降解特性分析_潘虎.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):298-307收稿日期：2022-11-07基金项目：国家自然科学基金项目（32060025）作者简介：潘虎，男，博士，副研究员，研究方向：农药残留检测与污染防控；E-mail:；潘虎同为本文通讯作者三株异菌脲高效降解菌株的筛选、鉴定及其降解特性 分析潘虎1，2，3 周子琼4 田云2（1.西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所，拉萨 850032；2.湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128 ；3.西藏自治区农畜产品工程技术研究中心，拉萨 850032；4.西藏农牧学院食品科学学院，林芝 860000）摘 要：为筛选适宜青藏高原地区的异菌脲高效降解菌株资源，采用富集培养法从西藏自治区蔬菜大棚土壤中分离得到Y-20、Y-29 和 Y-32 三株异菌脲高效降解菌株，通过形态特征、生理生化特性和 16S rRNA 基因序列分析对上述菌株进行初步鉴定，探讨 NaCl 浓度（m/V）、温度、pH 值、接种量（V/V）和异菌脲初始浓度等因素对其异菌脲降解速率的影响，采用气相色谱法和PCR 技术分析了上述菌株的异菌脲代谢途径及降解基因（ipaH）。结果表明，菌株 Y-20、Y-29 和 Y-32 为微杆菌属（Microbacterium）的 3 个不同种；在 1.0%NaCl（m/V）、pH 7.0、25-30、5%的接种量（V/V）和 100 mg/L 初始异菌脲浓度的最佳条件下，上述菌株能够在 8-12 h 内完全降解 100 mg/L 的异菌脲；上述菌株能够将异菌脲降解为 N-（3,5-二氯苯基）-2,4-二氧代咪唑烷和异丙基氨基甲酸，且含有高度相似的 ipaH 基因序列（99.14%-99.69%）。本研究为高原地区异菌脲污染环境的生物修复提供了菌株资源和理论依据。关键词：异菌脲；降解；富集培养法；微杆菌属；代谢途径；ipaH 基因；气相色谱法；酰胺酶DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1372Screening Identification and Degradation Characteristics of Three Iprodione-degrading StrainsPAN Hu1,2,3 ZHOU Zi-qiong4 TIAN Yun2（1.Institute of Agricultural Product Quality Standard and Testing Research,Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850032;2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128;3.Agricultural and Livestock Products Engineering Technology Research Center of Tibet Autonomous Region,Lhasa 850032;4.School of Food Science,Tibet Institute of Agriculture and Animal Husbandry,Nyingchi 860000）Abstract:To isolate the iprodione-degrading microbial resources suitable for Qinghai-Tibet Plateau,three efficient iprodione-degrading strain Y-20,Y-29 and Y-32 were isolated from the greenhouse soil in Tibet by enrichment culture method.These strains were preliminarily identified based on the morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics,and 16S rRNA gene sequence analysis.The effects of NaCl concentration（m/V）,pH value,temperature,inoculation amount（V/V）and initial iprodione concentration on the iprodione-degradation rates of these strains were also investigated.The metabolic pathways of iprodione and ipaH gene in these strains were analyzed using gas chromatography method and polymerase chain reaction technique,respectively.The results showed that strain Y-20,Y-29 and Y-32 were identified as three species of Microbacterium genus.Under the optimal iprodione-degrading condition of 1.0%NaCl（m/V）,pH 7.0,25-30,5%inoculation amount（V/V）and 100 mg/L initial iprodione concentration,100 mg/L iprodione was completely degraded by these strains within 8-12 h.These strains decomposed iprodione into N-（3,5-dichlorophenyl）-2,4-dioximidazolidine and isopropyl carbamate,and had a highly similar ipaH gene（99.14%-99.69%）.This study provides the strain resources and theoretical basis for the bioremediation of iprodione-contaminated environment at high altitude area.Keywords:iprodione;degradation;enrichment culture;Microbacterium;metabolic pathway;ipaH gene;gas chromatography;amidase2023,39(6)299潘虎等：三株异菌脲高效降解菌株的筛选、鉴定及其降解特性分析西藏自治区地处青藏高原腹地，特殊的高原地理环境和气候特征，导致绿色蔬菜严重缺乏，随着深入推进新时代农牧业供给侧结构性改革，不断优化完善农牧业区域空间和重点产业布局，西藏自治区深入推进“七大产业”建设，力争“十四五”时期全区蔬菜总产量达到 100 万 t 以上。蔬菜产业的大力发展，导致西藏自治区异菌脲等农药的施用量逐年增加，土壤及蔬菜的农药残留质量安全风险激增。异菌脲（iprodione）是一种高效广谱的二甲酰亚胺类杀菌剂（dicarboximides fungicide,DCFs），可有效抑制真菌孢子萌发和菌丝生长1，对核盘菌属（Sclerotinia）、灰葡萄孢属（Botrytis）、长蠕孢属（Helminthosporium）等真菌引起的植物病害具有良好的防治效果2-3。异菌脲对植物和鸟类具有中等毒性，对水生动物具有较高的毒性4-5；具有植物细胞遗传毒性，可导致染色体畸变和细胞死亡6；能够导致人体内分泌紊乱、降低荷尔蒙分泌、神经系统功能失调，甚至可能致癌7-8；能够对环境微生物群落结构造成不良影响，可导致环境微生物多样性下降和土壤肥力缺失等现象9。故开展异菌脲的降解机理研究是消除环境中异菌脲残留的重要途径，具有重要的经济价值和社会意义。异菌脲的降解方式主要有自然水解反应、光化学降解和微生物降解，其中微生物降解是消除环境中异菌脲残留的重要途径之一10-12。为此，国内外学者先后筛选出一些具有降解异菌脲活性的微生物，包 括 Arthrobacter sp.MA613、Pseudomonas sp.14、Arthrobacter sp.CQH15、Arthrobacter sp.C116、Microbacterium sp.YJN-G17、Bacillus sp.KMS-118、Paenarthrobacter sp.YJN-58等，但上述菌株对异菌脲的降解特性及条件存在差异，且应用适配性不强，影响其推广应用。目前，国内关于异菌脲降解微生物的研究报道较少，且尚无适配青藏高原地区的异菌脲高效降解菌株资源的相关报道，为了解决西藏地区土壤和蔬菜中异菌脲的残留问题，亟需挖掘适配西藏地区环境且能够高效降解异菌脲的微生物资源。本研究通过富集培养法从西藏自治区长期种植蔬菜的温室大棚土壤中筛选到 3 株异菌脲高效降解菌株，对上述菌株开展了形态学、生理生化和分子生物学的初步鉴定，同时开展了异菌脲降解特性、途径及基因分析，旨在为高原地区异菌脲污染环境的生物修复提供菌株资源和理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器 气相色谱仪（安捷伦 6890N，Agilent HP-5 毛细管色谱柱，30 m0.25 mm0.45 m），气相色谱-串联质谱仪（Bruker 450GC-320MSMS，Ag-ilent DB-5MS 毛细管色谱柱，30 m0.25 mm0.25 m），可控温摇床（金坛市精达仪器制造有限公司BS-4G），6321 型 PCR 扩增仪（德国 Eppendorf 公司），DYY-8B 型电泳仪（北京市六一仪器公司），Tanon Gis-2010 型紫外凝胶成像系统（天根生化科技（北京）有限公司）。1.1.2 培养基 无机盐培养基（MSM）：NH4NO3 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO47H2O 0.2 g，ZnSO47H2O 0.2 g，CaCl22H2O 0.25 g，pH 7.0，用水定容至 1 000 mL；Luria-Bertani培养基（LB）：酵母浸出物 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7.0，用水定容至 1 000 mL。1.1.3 试剂 异菌脲（纯度 96%）购置于 Toronto Research Chemicals Inc.，乙腈、正己烷、丙酮均为Thermo Fisher Scientific 公司色谱纯，氯化钠为成都联合化工有限公司分析纯，蛋白胨和酵母浸出物购于北京陆桥技术股份有限公司，API 20E 鉴定试剂条购于法国梅里埃公司。1.2 方法1.2.1 菌株的富集培养与分离纯化 2020 年 6 月，以西藏拉萨市、日喀则市和林芝市的西红柿、黄瓜和芹菜种植大棚内沙壤土为对象，采用灭菌后的不锈钢采样铲采集 5-15 cm 的土壤样品，每地采集土壤样品 3 份且每份土壤样品约 0.5 kg，土壤样品人工去除较大异物后混匀，4保藏备用。取混匀后的土壤样品 2.0 g 加入到 100 mL 含有 50 mg/L 异菌脲的 MSM 培养基中，于 25、180 r/min 富集培养。每隔 5 d 以 5%的接种量将富集培养上清液依次接种至含有 100、200、300 和 400 mg/L