剑麻均一化文库构建及PnRXLR5863靶蛋白筛选_杨子平.pdf

热带作物学报 2023,44(2):246-253 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-05-10；修回日期 2022-06-24 基金项目 现代农业产业技术体系建设专项资金项目（No.CARS-16）；海南省自然科学基金面上项目（No.320MS088）；广东省自然科学基金面上项目（No.2022A1515011841）。作者简介 杨子平（1984），男，博士，助理研究员，研究方向：植物分子生物学。*通信作者（Corresponding author）：周文钊（ZHOU Wenzhao），E-mail：。剑麻均一化文库构建及 PnRXLR5863 靶蛋白筛选 杨子平，杨 倩，汪 询，柯 智，鹿志伟，张燕梅，谌惠邦，周文钊*中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/湛江市热带作物遗传改良重点实验室，广东湛江 524091 摘 要：剑麻是硬质纤维的主要来源，由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）引起的斑马纹病是剑麻生产的重要病害。RXLR 效应蛋白是卵菌第一大类效应蛋白，能通过直接的蛋白质相互作用，靶向寄主防卫相关蛋白，干扰和抑制寄主防卫。利用转录组分析不同侵染阶段的烟草疫霉，发现 PnRXLR5863 表达量较高，并且其编码的蛋白含有信号肽、RXLR-EER 和 WY 结构域，瞬时表达发现 PnRXLR5863 能引起烟草细胞死亡，推测 PnRXLR5863 在烟草疫霉侵染剑麻过程发挥重要作用，但是它作用于剑麻的靶蛋白和致病机制还未知。为了筛选 PnRXLR5863 的剑麻靶蛋白，应用Switching Mechanism at 5 end of RNA Transcript（SMART）和 Duplex-Specific Nuclease（DSN）技术构建了剑麻均一化酵母 cDNA 表达文库，并筛选了与 PnRXLR5863 相互作用的蛋白。结果显示，构建的文库库容为 5.32107 CFU/mL，文库总克隆数为 1.064108 CFU，文库片段平均大小为 1000 bp，重组率为 100%；构建的 pGBKT7-PnRXLR5863 诱饵载体无自激活性；利用酵母双杂交系统，以 pGBKT7-PnRXLR5863 诱饵载体，从构建的文库中筛选获得 23 个与PnRXLR5863 相互作用的蛋白。获得的候选靶蛋白主要参与分子功能和生物过程，涉及泛素化过程、蛋白合成、蛋白翻译和蛋白修饰等生理事件，暗示 PnRXLR5863 效应蛋白可能作用于剑麻的蛋白代谢。剑麻均一化酵母表达文库的构建和 PnRXLR5863 靶蛋白的筛选，为进一步深入研究 PnRXLR5863 的致病机理奠定基础。关键词：RXLR 效应蛋白；剑麻；均一化文库；蛋白质相互作用；斑马纹病 中图分类号：S432.1 文献标识码：A Construction of Yeast Two-hybrid Normalized Library and Screening of Interaction Proteins of PnRXLR5863 in Agave hybrid No.11648 YANG Ziping,YANG Qian,WANG Xun,KE Zhi,LU Zhiwei,ZHANG Yanmei,SHEN Huibang,ZHOU Wenzhao*South Subtropical Crops Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Zhanjiang Key Laboratory of Tropical Crop Genetic Improvement,Zhanjiang,Guangdong 524091,China Abstract:Agave spp.is main resource of hard fiber.Zebra disease,caused by the pathogen Phytophthora nicotianae,is one of the most devastating sisal oomycete diseases.RXLR effector proteins are important cytoplasmic effectors of oomycete and more than 300 RXLR effector genes were identified in the genomes of P.nicotianae.RXLR effectors have the ability to manipulate or suppress host immunity by directly binding host proteins.A typical RXLR effector(named PnRXLR5863)that induced programmed cell death(PCD)was identified from P.nicotianae,but the targets in Agave were still unknown.This study aims to obtain the host plant proteins that are interacting with PnRXLR5863 in A.hybrid No.11648.A normalized cDNA library was constructed by combining Switching Mechanism at 5 end of RNA Transcript(SMART)and Duplex-Specific Nuclease(DSN)technology.The capacity of cDNA library was 5.32107 CFU/ml,the independent clones was 1.064108 CFU,and the lengths of inserts ranged from 0.5 kb to 3.0 kb,with the recombination rate of 100%.A total of 23 proteins interacting with PnRXLR5863 were obtained by sequencing and 第 2 期 杨子平等：剑麻均一化文库构建及 PnRXLR5863 靶蛋白筛选 247 homology analysis.Some of target proteins involve several physiological events,such as ubiquitination,protein synthe-sis,protein translation and protein translation,suggesting that PnRXLR5863 effector may act on protein metabolism of Agave spp.This research would lay a foundation for further study of the pathogenic mechanism of PnRXLR5863.Keywords:RXLR effector protein;Agave hybrid No.11648;normalized library;protein interaction;zebra disease DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.02.003 效应蛋白是病原微生物产生的一类有利于病原微生物侵染的蛋白质。卵菌中存在数量庞大的效应蛋白基因，其中 RXLR 类效应蛋白的数量最多。大豆疫霉约含有 396 个编码 RXLR 效应蛋白的基因，拟南芥霜霉菌有 134 个，橡树疫霉菌有 374 个，马铃薯疫霉菌有 563 个，葡萄霜霉菌有 100 个，烟草疫霉存在超过 300 个1-2。RXLR 效应蛋白的 N端含有约 20 个氨基酸的信号肽，在第 4090 位氨基酸处含有一个保 RXLR 基序，之后为序列多态性的效应分子功能区域，存在数量不等的 W、Y 或者L 基序3。RXLR 为胞内效应蛋白，可以抑制植物ROS 的产生、胼胝的沉淀和 SA 的含量等基础防卫反应。进一步研究发现，RXLR 效应蛋白能通过 C端功能域结合寄主内靶蛋白，调节寄主靶蛋白功能，抑制或者干扰寄主多个生理事件。例如Hyaloperonospora arabidopsidisd 的 HaRxLL470 与HY5 相互作用并抑制防御相关基因的转录4；大豆疫霉（Phytophthora sojae）的 PsAvr3c 与剪切体SKRP 蛋白互作，导致防卫相关蛋白的 Pre-mRNA剪切异常5；致病疫霉（Phytophthora infestans）的 PITG20303 靶向并稳定马铃薯免疫负调控因子丝裂原活化蛋白激酶 StMKK1，影响水杨酸信号通路6-7；大豆疫霉（P.sojae）的 PsAvh262 稳定内质网蛋白 BiPs，引起细胞坏死8-9。卵菌属烟草疫霉引起的斑马纹病，是剑麻生产中的主要病害。烟草疫霉通过游动孢子侵染剑麻的叶片，初期引起斑马纹的病症，之后逐步引起叶腐和茎腐10。目前关于剑麻斑马纹病的研究还处在病原物的分离鉴定、病原流行性方面，而对烟草疫霉侵染剑麻的致病机制缺乏深入研究。本课题组已对侵染剑麻不同时间的烟草疫霉进行了转录组测序，转录组检测到 214 个编码 RXLR的基因。其中 PnRXLR5863 表达水平高且表达水平变化显著，其编码的蛋白 N 端含有信号肽和RXLR-EER 结构域，C 端含有 W 和 Y 功能结构域。在烟草叶片中瞬时表达 PnRXLR5863，能引起细胞死亡，推测 PnRXLR5863 是侵染剑麻的关键 RXLR 效应蛋白，但是 PnRXLR5863 作用剑麻的靶蛋白和作用分子机制还不清楚。因此，本研究构建了剑麻酵母双杂交均一化 cDNA 表达文库，筛选了与 PnRXLR5863 相互作用的靶蛋白。结果为深入研究 PnRXLR5863 的致病机制奠定基础。1 材料与方法 1.1 材料 剑麻（Agave hybrid No.11648）采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所剑麻种质保存圃；Trizol 购自 Invitrogen 公司；Oligo(dT)、DNA clean beads 和 PCR mix 磁珠购自诺唯赞公司；均一化试剂盒购自 Evrogen 公司；反转录试剂盒、Hi-Fusion 试剂盒、EcoR I、双链 cDNA 纯化、酵母转化和文库构建试剂盒购自 Clontech 公司；用于 配 制 酵 母 培 养 基 的 试 剂 和 其 他 试 剂 购 自Sigma-Aldrich 公司。引物合成与 DNA 测序委托广州艾基生物技术有限公司。1.2 方法 1.2.1 总 RNA 的提取 采集 Agave hybrid No.11648植株叶片，液氮速冻。将样品研磨成粉，Trizol 法提取其总 RNA。采用 Oligo（dT）磁珠纯化 mRNA。1.2.2 RNA 的反转录 反应体系中加入 1.0 L CDS 和 1.0 L SMART 引物，1500 ng 的mRNA，DEPC H2O 补齐到 5 L，72 3 min，立即置于冰上。之后依次加入 1.0 L DTT，1.0 L dNTP，1.0 L MMLV Reverse Transcriptase，2.0 L 5First-Strand buffer，42 90 min，然后 70 15 min 终止，冷却至室温，加入 1 L RNase H，37 30 min，产物存放于80保存。CDS 引物和 SMART 引物序列见表 1。1.2.3