乳源外泌体在乳腺炎防控中的生物学功能研究进展.pdf

动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e乳源外泌体在乳腺炎防控中的生物学功能研究进展收稿日期:基金项目:国家自然科学基金地区项目();甘肃省杰出青年基金(J R R A )作者简介:赵莹(),女,黑龙江哈尔滨人,硕士研究生,主要从事兽医临床产科学研究.通讯作者赵莹,王萌,李志杰,马鑫,王立斌,张倩,余四九,潘阳阳(甘肃农业大学动物医学院,甘肃省牛羊胚胎中心,甘肃兰州 )摘要:外泌体是一种广泛存在于动物体液组织中的纳米细胞外囊泡.作为一种载体,包裹蛋白质、脂质、核酸、聚糖等,可介导细胞间的信息转递.乳源性外泌体,作为哺乳动物机体常见外泌体,被机体消化道吸收后可有效促进免疫系统和防御系统功能,其携带的m i R NA和功能蛋白质可改变乳腺上皮细胞基因表达,并参与细胞炎症反应和免疫应答调节.近几年国内外学者将乳源外泌体作为标记分子用于奶牛乳腺炎的诊断,或以其作为药物的载体或靶点,用于奶牛乳腺炎的预防和治疗.论文对有关乳源外泌体在乳腺炎防控中的研究进行了总结,帮助了解乳源外泌体在乳腺炎发生发展中的调节作用,旨在为进一步提升乳源外泌体在奶牛乳腺炎防治中的应用提供参考.关键词:外泌体;乳腺炎;内含物;巨噬细胞;微小R NA中图分类号:S 文献标识码:A文章编号:()外泌体以内出芽的方式产生,进而形成早期内吞小体、晚期内吞小体,是多囊泡体和质膜融合以胞吐方式向细胞间隙释放,由受体细胞接收而发挥作用,且广泛存在大部分体液中,如血浆、唾液、尿液、脑脊液,甚至还存在于人和动物的乳汁中.此外,机体还有许多种细胞可以分泌外泌体,如内皮细胞、肥大细胞、成纤维细胞以及肿瘤细胞等.外泌体由脂质、蛋白质和核酸组成,其核酸组分有D NA、mR NA、m i R NA、l n c R NA等.外泌体具有调控自身免疫机能、促进肠道发育、预防炎症、抑制肿瘤、促进软骨生长、调节生殖系统、修复组织等许多生理功能.乳源外泌体是乳腺上皮细胞产生的外泌体,并能包裹一些具有生物活性的内含物如蛋白质、脂质、核酸、聚糖等,这些内含物能被受体吸收,参与细胞间信息传递、免疫机能应答、细胞传递、血管新生、炎症反应、肿瘤细胞生长等.乳腺炎是严重影响全球奶牛业的经济和发展的疾病之一,全球亚临床乳腺炎和临床乳腺炎患病率分别为 和.诱发乳腺炎的因素非常多,如细菌、真菌感染等,卫生条件、饲料等因素,挤奶应激、管理饲养不当以及遗传因素等.目前常见的乳腺炎诊断方法有体细胞计数法、乳汁细菌培养法、分子检测法、乳汁p H检验法、蛋白质组学分析等方法,而且治疗乳腺炎也有很多方法,如抗菌药物疗法、激光疗法、物理疗法、生物制剂疗法、中草药疗法等.近几年有研究发现,乳源外泌体中的m i R NA在乳腺癌、乳腺炎以及其他乳腺疾病发生时发挥着关键调控作用.本文针对乳腺炎为奶牛产业健康发展的威胁,结合外泌体生物功能的不断挖掘,从乳源外泌体的发现、乳腺炎病原菌对乳源外泌体影响、外泌体防治乳腺炎的分子机制等方面进行乳源外泌体在乳腺炎防控中的生物学功能综述,旨在为进一步提升乳源外泌体在防治乳腺炎中的应用提供参考.乳源外泌体的发现细胞外囊泡从 年试验鼠体内肿瘤细胞发现,到 年被命名为外泌体,随后通过不同细胞机制发现外泌体存在信息传递功能,从而展开了大量的研究.后期发现机体内的多种细胞都可以分泌外,并且对机体发挥的作用不同.近些年来国内外学者在乳腺上皮细胞分泌的外泌体研究上有了很大进展,乳源外泌体富含与免疫应答和生长有关的蛋白质,通过调节这些蛋白质可调节机体免疫机能和生长修复.外泌体是乳腺癌相关蛋白质和表面生物标记物的来源,可以广泛应用于疾病的诊断和预后的判断.乳腺癌来源的外泌体在促进乳腺癌血管生成和转移方面的发挥关键作用.还有许多有关乳源外泌体的研究进展,为了进一步研究探索乳源外泌体,需要先了解外泌体的成分及如何分离鉴定.乳源外泌体的分离鉴定方法经过众多国内外学者不断深入研究,发现外泌体的分离和鉴定在临床应用和进一步试验研究中尤其重要.但分离鉴定的方法众多,且评判标准不同,另优缺点各异,所以要根据实际应用情况选择最适合的分离鉴定方法.乳源外泌体分离方法乳源外泌体研究常用的超速离心法、蔗糖密度梯度离心法以及化学沉淀法(试剂盒法),进行分析其各自的原理和优缺点.超速离心法是最常用的分离方法,操作成本低,且不使用额外化学试剂,适用于大量提取,但操作耗时,设备成本高,且反复离心可破坏外泌体造成损伤,外泌体分离彻底干净适用大量分离样品及进一步组学分析,其原理是根据比重和大小同采用不同离心力和离心时间物理离心纯化外泌体;蔗糖密度梯度离心法是多数研究者用于乳中外泌体的提取方法,是在超速离心基础上加入蔗糖介质使管内产生由管口向管底依次升高的密度梯度.该方法对蛋白质聚集物分离彻底纯度高,外泌体分离彻底适用于大量提取,但操作步骤复杂耗时长,离心时会对外泌体造成机械性损伤,其原理是根据乳中成分的沉降系数的不同在不同浓度梯度上形成沉淀从而分离外泌体;化学沉淀法(试剂盒法)也可用于乳源外泌体的提取,该方法操作简单耗时短,且获取的外泌体形态完整,但纯度不高易有污染物如聚合物、脂蛋白等的影响,不适用蛋白组学分析且化学试剂盒费用高,其原理是通过话化学提取将获取的含外泌体样品加入试剂盒内液体使其沉淀,从而分离外泌体.乳源外泌体鉴定方法为应用于临床应用和试验研究,获取的外泌体需要通过不同方法来评估其纯度和完整性.在外泌体的鉴定中通常先后应用多种鉴定方法来互相验证,如形态鉴定、大小鉴定、表面标记物鉴定等.外泌体形态鉴定.电子显微镜是鉴定外泌体形态最常用的方法,可鉴定外泌体的电子显微镜有许多种,如透射电子显微镜、扫描电子显微镜、冷冻电子显微镜和原子力显微镜,且可观察其外泌 体 精 细 形 态.透 射 电 子 显 微 镜 可 分 辨n m以内直径的图像,其鉴定原理是将外泌体固定在网上并染色干燥,再用透射电子显微镜调整视野观察拍照,对比形态鉴定外泌体.鉴定的乳源外泌体多数呈圆形或椭圆形,局部凹陷,结构完整大小不一,通常直径在 n m左右的双层膜结构.外泌体大小鉴定.外泌体大小鉴定可通过纳米粒子跟踪分析和动态光散射技术可实时检测纳米粒子大小和浓度,测量悬浮粒子分布.其纳米粒子跟踪分析技术原理是纳米粒子常用一束光照射,当光被纳米粒子散射并发生布朗运动时,便可记录纳米粒子运动路径、扩散系数和平均速度;动态光散射技术其原理是粒子在悬浮液中布朗运动以及对散射光干涉,将波动系数转换扩散系数代入S t o k e d E i n s t e i n方程计算获得粒子直径大小,对比大小鉴定外泌体.鉴定的乳源外泌体粒径大小主要集中高峰在 n m左右.外泌体表面标记物鉴定.外泌体表面特异标记物鉴定属于生化方面的鉴定,主要通过免疫印迹法和纳米流式细胞术对外泌体进行鉴定.免疫印迹法是对外泌体表面特异蛋白标记物鉴定,其原理是将外泌体裂解、电泳、转移固定在硝化纤维素膜上孵育,并标记蛋白质如T S G 、C D、C D 、C D 、A L I X等,经过多次洗脱后曝光成像进行鉴定.纳米流式细胞术是对外泌体颗粒大小和体积鉴定,其原理是利用流式细胞仪对荧光标记表面抗体的外泌体识别进行鉴定.鉴定的乳源外泌体可丰富表达标记蛋白.乳源外泌体的主要成分外泌体由脂质、蛋白质和核酸组成,并具有脂质双分子层的庇护,可以稳定存在.乳源外泌体的脂质组分主要包括胆固醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、磷脂、饱和脂肪酸、神经酰胺等,参与外泌体质膜分裂、融合等过程.外泌体中脂类含量较少且不易保存,所以相关报道较少,需进一步探索研究.乳源外泌体的蛋白质组分多数来自核内体、细胞质、质膜,由于外泌体是多囊泡体和质膜融合以胞吐方式向细胞间隙释放,所以外泌体聚集的蛋白质主要是膜融合和转移相关蛋白和外泌体形成相关蛋白,其次还包括各种不同来源外泌体均含有的相似蛋白质,如热休克蛋白、四分子交联体家族(C D 、C D、C D 、C D )、整 合 素、选 择 素、细 胞 骨 架 蛋 白(A L I X、T S G )、黏附分子、MHC家族蛋白、受体等,且 可 作 为 标 记 蛋 白 进 行 外 泌 体 鉴 定.M e iY a n g等 在人和奶牛乳样品中乳源性外泌体鉴定和定量出 种蛋白质并发现 个差异表达蛋白.表明乳品含有多种蛋白质且人乳和牛乳中外泌体蛋白存在差异.乳源外泌体的核酸组分主要包括D NA、m i c r o R NA、l n c R NA、c i r c R NA、mR NA、t R NA s、r R NA s、s n R NA s、s n o R NA s等.年首次研究发现外泌体中存在核酸,之后开展大量研究.蔡明成 发现外泌体核酸组分中mR NA、m i R NA、l n c R NA可被运输到受体细胞中并调节基因表达.而m i R NA是基因表达中重要的转录后调控因子,在人畜生理及病理过程中发挥重要作用.赵莹等:乳源外泌体在乳腺炎防控中的生物学功能研究进展主要乳腺炎病原菌对乳源外泌体影响奶牛可因乳腺感染而改变乳源外泌体的成分,可根据改变的乳源外泌体中成分来防控乳腺炎.而细菌感染是发生乳腺炎的重要原因,主要有大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等.乳腺中细菌病原体入侵机体后首先接触乳腺上皮细胞.细菌感染和乳腺免疫最初的重要位置也是乳腺上皮细胞,乳腺上皮细胞不仅促使机体最早对病原微生物的免疫识别和应答,并协调后续免疫分子和细胞的重要应答作用.以下种常见引起乳腺炎的病原菌对乳源外泌体的影响,并阐述通过成分的差异表达来诊断和预防乳腺炎.大肠埃希氏菌对乳源外泌体分泌的影响脂多糖(L P S)又称内毒素,是大肠埃希氏菌细胞壁的主要成分,可以引起一系列的免疫反应来激活乳腺上皮细胞表面的受体.当上皮细胞受到大肠埃希氏菌的刺激后,产生的外泌体以远距离扩散的方式调节中性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤性细胞等免疫细胞的功能,进而影响乳腺炎的发生发展.大肠埃希氏菌对乳源外泌体分泌中的多个成分均有影响,应易恬等 试验证明大肠埃希氏菌感染患乳腺炎分泌的外泌体中有 种基因表达出现明显改变.脂多糖刺激乳腺上皮细胞分泌外泌体中m i R NA的表达水平有种升高和种下降,其中m i R NA b p上升倍,说明m i R NA b p是脂多糖诱导患乳腺炎中的炎症调节因子并发挥关键调节作用.脂多糖刺激乳腺上皮分泌外泌体中有 种蛋白差异表达,其中 种表达水平上升,种表达水平下降,差异蛋白可执行蛋白质和R NA结合等功能并参与调节通路和蛋白代谢等过程,说明差异表达的蛋白可作为诊断和治疗乳腺炎的标记物并发挥免疫调节功能.用细胞培养、超速离心、透射电镜和W e s t e r nb l o t等综合方法分离鉴定出外泌体,并对照外泌体中的种特异性蛋白标记物(C D 、H S P 、H S P ),证明内毒素可以影响乳腺上皮细胞产生的外泌体表面标记物的表达,通过检测乳源外泌体表面标记物的表达异常来诊断和预防乳腺炎.金黄色葡萄球菌对乳源外泌体分泌的影响金黄色葡萄球菌主要引起亚临床乳腺炎且潜伏期长、隐性发作、高度接触性传染.金黄色葡萄球菌对乳源外泌体分泌中的多个成分均有影响,对金黄色葡萄球菌感染患乳腺炎奶牛和健康奶牛分泌的外泌体R NA测序,发现其中 种基因、种l n c R NA、种mR NA均出现差异表达,说明在病原菌侵袭和黏附、氧化应激、炎症和凋亡中起调节作用.用二代测序法检测金黄色葡萄球菌感染患乳腺炎分泌的乳源外泌体,有 种m i R NA表达量出现明显差异,其中m i R NA 和m i R NA 可作为金黄色葡萄球菌感染患乳腺炎奶牛的诊断标记物,并发现金黄色葡萄球菌感染患乳腺炎奶牛分泌的外泌体种有 种c i r c R NA表达量出现明显差异.从正常奶牛和金黄色葡萄球菌感染患乳腺炎的奶牛中,用超速离心等多种方法提取乳源外泌体,发现乳源外泌体中有 种m i R NA,其中发现m i R NA 、m i R NA b、m i R NA b在组织中出现差异表达,