健脾通络方对结直肠癌细胞侵袭迁移的影响及机制研究_黄人可.pdf

39国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1 论著 健脾通络方对结直肠癌细胞侵袭迁移的影响及 机制研究黄人可 任建琳 靖 琳 吴杏黎 刘湘君 刘 怡 储金砚【摘要】目的 探究健脾通络方对结直肠癌细胞侵袭、迁移的影响及机制。方法 构建敲减 MALAT1 基因的 HCT116 细胞模型。采用细胞划痕实验和 Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力。采用蛋白质印迹法检测经健脾通络方干预后的MALAT1 正常/敲减表达的 HCT116 细胞中 Wnt3a、-catenin 蛋白水平。采用实时荧光定量 PCR 法检测 MALAT1 的表达水平。构建裸鼠肺转移模型，采用小动物活体成像技术监测肿瘤转移情况，并检测转移灶中 Wnt3a、-catenin 和 MALAT1 的表达水平。结果 经健脾通络方干预后，HCT116 细胞中 MALAT1、Wnt3a 和-catenin的表达水平均降低，HCT116 细胞迁移能力下降。在裸鼠肺转移模型中，经健脾通络方干预后裸鼠的转移灶减少，转移灶中 Wnt3a、-catenin 和 MALAT1 的表达水平均降低。结论 健脾通络方通过下调HCT116细胞中MALAT1的表达，使Wnt/-catenin信号通路中 Wnt3a、-catenin 的蛋白表达水平降低，从而抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。【关键词】结直肠癌；侵袭；迁移；MALAT1；Wnt/-catenin 信号通路DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2022.06.009Effect of Jianpi Tongluo Decoction on invasion and migration of colorectal cancer cells and its mechanism HUANG Renke,REN Jianlin,JING Lin,WU Xingli,LIU Xiangjun,LIU Yi,CHU Jinyan.Department of Oncology,Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China【Abstract】Objective An attempt is made in this paper to investigate the effect and mechanism of Jianpi Tongluo Decoction on invasion and migration of colorectal cancer cells.Methods The MALAT1 knockdown HCT116 cell model was constructed.Cell scratch test and Transwell test were conducted to detect cell invasion and migration.Western blotting was conducted to detect Wnt3a and-catenin protein levels in HCT116 cells with normal/knockdown expression of MALAT1 after treatment with Jianpi Tongluo Decoction.The expression of MALAT1 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.The lung metastasis model of nude mice was established,and the tumor metastasis was monitored by utilizing the small animal in vivo imaging technology.The expressions of Wnt3a,-catenin,and MALAT1 in metastatic lesions were detected.Results The expressions of MALAT1,Wnt3a,and-catenin in HCT116 cells are decreased after treatment with Jianpi Tongluo Decoction,and the migration ability of HCT116 cells is decreased.In the lung metastasis model of nude mice,the metastatic lesions of the nude mice treated with Jianpi Tongluo Decoction are reduced,and the expressions of Wnt3a,-catenin,and MALAT1 in the metastatic lesions are decreased.Conclusion Jianpi Tongluo Decoction inhibits the proliferation,invasion,基金项目：国家自然科学基金面上项目（81873279、82174452、81473628）；上海市科委科技支撑“中药新药临床前研究”项目（22S21901000）；上海申康医院发展中心“临床三年行动计划”疑难疾病精准诊治攻关项目（SHDC2020CR2047B）；上海市中医医院中医药传承院级名中医人才培育-院级名中医（WLJH2021ZY-MZY026）作者单位：200071 上海中医药大学附属市中医医院肿瘤科通信作者：任建琳，Email:40国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1and migration of colorectal cancer cells by down-regulating the expression of MALAT1 in HCT116 cells and mediating the reduction of Wnt3a and-catenin protein expression in Wnt/-catenin signaling pathway.【Key words】Colorectal cancer;Invasion;Metastasis;MALAT1;Wnt/-catenin signaling pathway结直肠癌是常见的消化道肿瘤，根据 2022年国家癌症中心发布的全国癌症数据统计显示，2016 年中国结直肠癌新发病率为 40.8/10 万，病死率为 19.6/10 万，均呈上升趋势1。结直肠癌起病隐匿，约 61.8%的患者确诊时疾病已进展至中晚期，患者 5 年总生存率仅为 10.5%2-3。MALAT1 是一种与肿瘤相关的长链非编码 RNA（lncRNA），最初被确定为非小细胞肺癌转移的重要标志物4。MALAT1 的高表达提示肿瘤患者预后不良，研究发现 MALAT1 参与了肿瘤细胞迁移相关基因的调节5。本课题组的前期研究结果表明，MALAT1 在结肠癌组织中的相对表达量是癌旁组织的 2.22 倍，并且 MALAT1 在结直肠癌转移灶中的表达水平明显高于原发灶6。中医药是恶性肿瘤的重要辅助治疗方式。在临床上，湿热和脾虚是结直肠癌的常见证型7，结直肠癌各个阶段贯穿着脾虚证，脾虚证与结直肠癌的进展有着密切关系。本课题组的前期研究结果表明，健脾为主的扶正中药可延长结直肠癌术后总生存期、晚期结直肠癌总生存期及无病生存期8-9。健脾通络方是基于络病理论针对中晚期结直肠癌的临床经验方。本研究拟通过检测健脾通络方对结直肠癌细胞侵袭、迁移的影响，探索其对结直肠癌的疗效及相关机制。1 材料与方法1.1 实验材料BALB/c 免疫缺陷裸鼠 40 只，雄性，4 周龄，体质量为 1315 g，均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司 合格证号 SYXK（沪）2014-0008。人结肠癌上皮细胞株 HCT116 细胞由中国科学院细胞库提供。lncRNA MALAT1 敲减慢病毒购自吉满生物科技（上海）有限公司，货号 GM-CS-121969；异氟烷购自美国 Baxter Healthcare Corporation 公司，货号 CN2L9100；D-萤光素钾盐购自上海睿铂赛生物科技有限公司，货号 12507。本实验所用仪器包括 Applied Biosystems VeritiPro PCR 仪（购自美国Thermo Scientific 公 司）、ChemiDocTM XRSSystem with Image LabTM Software 型 Image Lab 影像采集系统（购 自 美 国 Bio-Rad 公 司）和 Ami HT/HTX 小动物冷光荧光活体影像系统（购自美国 Spectral Instrument Imaging 公司）。健脾通络方由生黄芪30 g、苦参15 g、党参15 g、炒白术 15 g、白茯苓 15 g、炒薏苡仁 15 g、白花蛇舌草 30 g、天龙 3 g、蜈蚣 3 g、甘草 6 g 组成，累计给药剂量为 195.3 g/kg。上述中药材取自上海市中医医院中药房。根据课题组前期实验结果，健脾通络方给药剂量为 20 mg/mL。中药饮片通过醇提的方法进行浓缩提取，调整质量浓度为 1 g/mL，在超净台中使用 0.22 m 规格的过滤器过滤除菌后使用。1.2 敲减细胞模型构建与细胞培养使用慢病毒转染 HCT116 细胞构建 MALAT1敲减表达模型。将 HCT116 细胞消化后接种至 12孔板中（密度为每孔 2105个细胞），按 MOI100 稀释病毒原液，将含有慢病毒液的培养基加入 HCT116 细胞中。在感染 16 h 后，将含有慢病毒的培养液更换为 1 mL 完全培养基。经药筛待细胞稳定后，使用 RPMI-164010%胎牛血清1%青链霉素双抗15 g/mL Blasticidin 完全培养基维持细胞。将 MALAT1 正常表达的 HCT116 细胞设为HCT116-NC 组，将 MALAT1 敲 减 表 达 的 HCT116细胞设为 HCT116-KD 组。将 MALAT1 敲减表达的HCT116 细胞与 MALAT1 正常表达的 HCT116 细胞上清液共培养，设为 HCT116-KDNC-exo 组；将MALAT1 正常表达的 HCT116 细胞与 MALAT1 敲减表达的 HCT116 细胞上清液共培养，设为 HCT116-NCKD-exo 组；2 组共培养时间均为 24 h。1.3 检测项目与方法1.3.1 HCT116 细胞增殖情况 使用 CCK-8 试剂盒检测HCT116细胞增殖情况。灭菌96孔板每孔注入 100 L生长良好的HCT116细胞（密度为5.5104个/mL），置于 37、5%CO2无菌恒温培养箱中；10 h 后弃去旧液，更换为含 1%胎牛血清的培养液，继续培养 24 h 后，分别给予上述细胞不同质量浓度的健脾通络方（0、30、60、90、120、150、180 mg/mL）干预，每组设立 3 个复孔。培养 24 h 后，吸弃旧液，加入 90 L RPMI-1640 无血清培养基和 10 L CCK-8 溶液，继续培养 2 h 后，使用酶联检测仪（双波长 490 nm/630 nm）检测光密度（OD）值，统计41国际消化病杂志 2023 年 2 月第